血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取与分离
专题5 DNA与蛋白质技术第三节血红蛋白的提取和分离【课题目标】（一）知识与能力目标1、掌握基本概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液。
2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
3、了解大分子蛋白质提取的一般过程：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
（二）学科素养1、基础知识：从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
2、基本技能：体会从生物组织材料中提取生物大分子的一般流程，培养学生理论联系实际的能力。
3、基本思想：通过科学发现和科学探究，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。
4、情感与态度：理论与方法的关系容易使学生形成科学的理性和客观的认知、以及发展的思维，使学生形成严谨的做事风格和追求成功的不懈态度。
【课题重点与难点】重点：凝胶色谱法和电泳法的原理和操作。
难点：样品的预处理；色谱柱制作与洗脱。
【教学方法】启发式教学；多媒体辅助教学。
【教学过程】（一）引入新课生物大分子分离纯化在现实生活和科学研究中具有重要的意义。
如在生命科学研究中，我们需要从生物材料中分离纯化核酸、蛋白质等，才能对其结构和功能进行研究。
在医学检测和医疗实践领域，只有获得相关物质才能展开相关的研究。
通过基因工程的学习，我们已经掌握基因工程疫苗和药物的制取方法，而药物成品的获得，同样离不开物质的提取与分离。
（二）展开新课1．蛋白质分离纯化的原理根据蛋白质的理化性质的差异：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等，采用不同的方法提取和分离各种蛋白质。
2.大分子分离纯化的一般程序（1）样品处理：思考：血液有哪些成分？思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
a.红细胞的洗涤:b.血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）c.分离血红蛋白溶液：（2）粗分离（粗分级分离）粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开盐析(salting out)概念：指在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
课题3 血红蛋白的提取与和分离
(二）、凝胶色谱操作---血红蛋白的纯化
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1. 6 厘米的玻璃管，两端磨平
②底塞制作:打孔→挖凹 穴 +安装移液管头部→ 覆盖尼龙网，再用100目 尼龙纱包好。
③顶塞制作 ④组装
注意:底塞中插入的玻璃管的上部不得超出 橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
(2)固定化细胞可以用海藻酸钠，其作用是___包___埋__细__胞____， 加热溶化后的海藻酸钠需冷却到室温才可以加入菌体的原因 是 防止温度高导致微生物死亡 ； 该操作还需要使用氯化钙溶液，其作用是________________。
促进海藻酸钠和微生物混合液形成凝胶珠（或交联剂）
(3)整个操作过程需要在无杂菌的条件下进行，对使用到的玻璃
2.本实验中所用的缓冲液
磷酸缓冲液 目的：利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。
(三)电泳 1.电泳的概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。
若想尽快达到理想的透析效果可采取的措施是?
（练习）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血 红可（ 分蛋以3离）白选，同完用在学成猪电甲的、泳利，牛过用血 、程琼红 羊中脂蛋 或，糖白 其影凝的 他响胶主 脊蛋电要 椎白泳功动质技能物迁术是的移将携血速得带液率到O进的的2行因或蛋实素C白O验包2质，括，进来我行提们取 和蛋分白离质血带电红性蛋质白。、根分据子材本料身回大答小下以列及问分题子：的形状 不同等。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白是红细胞中含有的一种蛋白质，具有运输氧气的重要功能。
血红蛋白的提取和分离，对于研究红细胞的结构和功能具有重要意义。
以下将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
1. 血液采集
血液采集是血红蛋白提取和分离的第一步。
采集血液前需要做好消毒工作，以免造成感染。
通常采用采血针直接穿刺人体静脉进行采血。
采血过程中需要避免空气进入血管内，避免血液凝固。
2. 离心分离红细胞
血液样品采集后需要将其进行离心分离，从而将红细胞与其他血细胞分离开来。
离心分离的目的是利用红细胞在血液中的自身重量和密度不同来分离。
常用的离心分离方法是缓速离心法。
离心过程中，需要注意速度、时间和离心管的位置，避免红细胞和其他血细胞混合。
3. 血红蛋白提取
提取血红蛋白是将红细胞中含有的血红蛋白分离出来。
血红蛋白提取的常用方法是破细胞法和溶血法。
破细胞法是将红细胞破裂，使血红蛋白溶于液体中。
溶血
法是将红细胞置于一定浓度的盐水溶液中，使红细胞破裂，并分离出血红蛋白。
提取后的血红蛋白需要进行纯化和浓缩。
4. 血红蛋白性质分析
血红蛋白提取后需要进行性质和结构分析，从而了解血红蛋白的生化特性和分子结构。
常用的分析方法包括分子量测定、电泳分离和质谱分析。
这些方法不仅能够分析血红蛋白的基本结构和功能，还能够探究血红蛋白的异常变异和相关疾病。
以上是血红蛋白提取和分离的四个步骤，血红蛋白的提取和分离对于研究红细胞的结构和功能具有重要意义，未来还会有更多新的方法和技术被应用到血红蛋白的提取和分离研究中。
血红蛋白的提取与分离
决定 运动方向 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ 电场 作用力 形成 阻力 决定 运动速率
二 、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：P66 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
（一）样品处理及粗分离 P66
(1)红细胞的洗涤P67
(2)血红蛋白的释放 P67
加（ 蒸馏水 ）到（ 原血液 ）体积 再加40％体积的（ 甲苯 ）（ 溶解细胞膜） ， 置于（ 磁力搅拌器 ）上充分搅拌10分钟 （加速细胞破裂） ④细胞破裂，释放出血红蛋白.
(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转
移到离心管中，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: p67
第1层（无色透明）甲苯层 第2层：（白 ）色薄层固体，脂溶性物质
第3层：（红色透明）的水溶液层 （血红蛋白 ）的液体 第4层：其它杂质（ 暗红色 ）的沉淀物
将试管中的液体用 滤纸过滤。 除去脂溶性沉淀层。 ④于分液漏斗中静置 片刻。 ⑤分出下层的红色透 明液体。
(4)粗分离：即透析。 P67
（三）实验结果分析与评价 P70
知识总结 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离
蛋白质分子的差异性 凝胶色 谱法 原理 分离过程 凝胶电 泳法 缓冲溶液
蛋白质的 提取分离 组成 样品处理 纯度鉴定 作用 粗分离 纯化
①采集血样。②低速短时间离心（速度越高和 时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达 不到分离的效果）用胶头吸管吸出上层透明 的黄色血浆。④下层暗红色的红细胞生理盐水 洗涤。⑤低速短时间离心⑥重复洗涤三次。
④、⑤步骤（ 三 ）次，直至上清液中已没 有（ 黄色 ），表明洗涤干净。利于后续血红 蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步血红蛋白是存在于人类血液中的一种重要蛋白质，它承担着将氧气从肺部输送到身体各个组织和器官的重要功能。
因此，对血红蛋白的提取和分离具有重要的生物学意义和医学应用前景。
接下来将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
第一步：血样采集首先需要采集含有血红蛋白的血样。
一般来说，静脉采血是最常用的方法。
在采集血样之前，需要确保采血器具干净无菌，以避免外部微生物的污染。
同时，还要确保采集到的血样足够新鲜，以保证血红蛋白的活性和稳定性。
第二步：红细胞裂解将采集到的血样进行红细胞裂解，将红细胞膜破坏，释放血红蛋白。
一般可以使用生理盐水等溶液进行红细胞裂解。
在裂解的过程中，需要注意温度和pH值的控制，以确保血红蛋白的完整性和稳定性。
第三步：血红蛋白提取在红细胞裂解后，血液中的血红蛋白被释放出来，需要进行进一步的提取。
常用的提取方法包括离心、凝胶过滤、离子交换层析等。
通过这些方法，可以将血红蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到比较纯净的血红蛋白样品。
第四步：血红蛋白分离最后一步是对提取到的血红蛋白进行分离。
根据血红蛋白的性质和不同的应用需求，可以选择不同的分离方法。
例如，可以利用凝胶电泳、高效液相色谱等技术对血红蛋白进行分离和纯化。
通过这些方法，可以得到高纯度的血红蛋白样品，为后续的研究和应用提供基础。
通过以上四个步骤，我们可以完成血红蛋白的提取和分离工作。
这些工作不仅有助于深入了解血红蛋白的生物学功能和结构特性，还为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的基础。
希望在未来的研究中，可以进一步完善血红蛋白提取和分离的技术，为人类健康事业做出更大的贡献。
高中生物人教版选修一血红蛋白的提取和分离
【一题多变】 1．图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什
么？ 答案 负电荷，因为它们移向了阴极一端。 2．除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法 还有哪种？ 答案 琼脂糖凝胶电泳。
二、血红蛋白的提取和分离实验操作 1．样品的处理
(1)红细胞的洗涤 ①目的：去除杂蛋白。 ②方法 a．采集血样→b.低速短时间离心→c.吸取血浆→d.盐水洗 涤→e.低速离心→重复d、e步骤三次。
(3)作用 电泳利用了待分离样品中各种分子 带电性质 的差异及分子本 身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的 迁移速度， 从而实现样品中 各种分子的分离 。 (4)方法 常用的电泳方法有 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质分子量时通常使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 。
二、 血红蛋白提取和分离的实验操作与评价 1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、
2．凝胶色谱操作
3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度 的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳。
4．结果分析与评价
项目
分析
①分层明显→样品处理完成
血液样 品的处
理
②分层不明 显的原因
洗涤次数少，未能 除去血浆蛋白 离心速度过高或 时间过长
(2)原理 ①由多孔球体 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 通道 。 ②当 相对分子质量 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质 量 较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 较长，移 动速度 较慢 ，而相对分子质量 较大 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程 较短 ，移动速度 较快 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 分离。
【高中生物】高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离
【高中生物】高中生物知识点：血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离：1、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
（1）凝胶色谱法（分配色谱法）：①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
③分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
④作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
（2）缓冲溶液①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3?NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
(3）凝胶电泳法：①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质?SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2、实验步骤（1）样品处理① 红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。
加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
血红蛋白的分离和提取
02
血红蛋白分离和提取的方 法
离心法
要点一
总结词
离心法是一种利用离心力分离不同密度物质的方法，常用 于血红蛋白的分离和提取。
要点二
详细描述
离心法的基本原理是利用不同物质在离心场中的沉降速度 不同而实现分离。在血红蛋白的分离中，通常将红细胞悬 浮液置于离心管中，在高速离心机中以一定速度旋转，红 细胞由于密度较大而沉降到底部，上清液即为去除了红细 胞的血浆，而红细胞中包含大量的血红蛋白，因此通过离 心法可以获得较为纯净的血红蛋白。
子交换剂表面的离子进行可逆交换，从而实现血红蛋白与其他杂质的分离。
亲和层析法
• 总结词：亲和层析法是一种利用生物分子间的特异性亲和力进行分离的
方法，常用于血红蛋白的分离和提取。
• 详细描述：亲和层析法的原理是利用生物分子间的特异性亲和力将目标分子吸附在固定相上，通过改变洗脱液的组成将 目标分子从固定相上洗脱下来而实现分离。在血红蛋白的分离中，常用的亲和层析方法为铁结合亲和层析和珠蛋白亲和 层析。铁结合亲和层析是利用血红蛋白与铁离子之间的特异性亲和力将血红蛋白吸附在固定相上，通过改变洗脱液的组 成将血红蛋白从固定相上洗脱下来。珠蛋白亲和层析是利用珠蛋白与血红蛋白之间的特异性亲和力将血红蛋白吸附在固 定相上，通过改变洗脱液的组成将血红蛋白从固定相上洗脱下来。
血红蛋白具有低免疫原性和良好的携氧能力，可以作为药物载体用于药物传递和靶向治疗，提高药物的疗效和降 低副作用。
血红蛋白在生物材料中的应用
血红蛋白作为一种生物材料，具有优良的生物相容性和可降解性，可以用于制备人工器官、组织工程和生物材料 等。
05
血红蛋白分离和提取的展 望
新技术的研发和应用
01
02
血红蛋白的提取与分离
②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶
色谱分离时可以通过观察颜色来判断
什么时候应该收集洗脱液。这使血红
蛋白的分离过程非常直观，大大简化
了实验操作。
•1.洗涤目的：去 红细胞的洗涤 杂蛋白 除 ，利于后 或血浆蛋白 2.洗涤方法 续步骤的分离纯化。
采用低速短时间离心，如 500 用 胶头吸管 r／min,离心 2 min，然后
离 心 管 中 ， 以 2000 r ／
min的速度离心10min后，
可以明显看到试管中的溶
液分为4层：
高速长时间离心
第4层：红细胞破碎物沉淀 层（暗红色）
用 滤纸 过滤除去脂溶性 沉淀层，于 分液 漏斗中
静置片刻后，分出下层 的 红色 透明液体。
粗分离
--透析（去除分子质量较
小
的杂质）
取1mL的血红蛋白溶液装入 透 （pH为7.0 ）透析12 h。
A. 它们都是分离蛋白质的重要方法 B. 它们的原理相同不同
)
C. 使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 都需要使用缓冲溶液维持PH D. 以上说法都正确
实验步骤
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理
红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
透析—去除样品中分子量较小的杂质
粗分离
纯化 用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质
合物，SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的
电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳
迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
例题5.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的
原因的是( D )
A.分子带电性质的差异
B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度
5.3血红蛋白的提取和分离
分离、纯化生物大分子
大分子：分子量达上万或更多的有机生物活性分子 分离：将混杂的各物质通过物理或化学方法分成几种纯净物 纯化：除去物质中混有的杂质（不需要的）
分离纯化生物大分子方法
分离依据
具体方法
分子大小（相对分 1.凝胶色谱法（柱层析） 子质量）和形态 2.差速离心法（分离各种细胞器）
3.密度梯度离心法（分离不同密度物 质，如14N、15N标记的DNA） 4.透析法、 5.分子筛……
与CO结合 比O2与血红蛋白结合能力强270倍
背景知识：血红蛋白
1.概念：红细胞内负责运输O2和CO2的特殊红色蛋白质，英文缩写Hb。 2.血红蛋白的结构：2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 3.血红蛋白的功能： ·运输作用 O2 CO2 CO ·结构作用：组成人和其他脊柱动物红细胞的主要成分（结构蛋白）
（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
结果分析: • 测定的只是单个亚基或肽链的相对分子质量，而不是完整分子的
相对分子质量；
• 要测定蛋白质真正的相对分子质量，应与其他测定蛋白质相对分 子质量的方法加以校正。
五、 凝胶电泳法
常见种类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分类 琼脂糖 凝胶电 泳
SDS-聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳
总结思考：
1、凝胶色谱法原理？ 2、缓冲溶液作用？ 3、电泳原理？
小分子流动慢 大分子流动快
先收集 大分子
后收集 小分子
5.结果：洗脱曲线
横轴：洗脱液体积； 纵轴：分子浓度 按照分子大小洗脱：大分子先洗脱下来，小分子后洗脱下来
思考： 在血红蛋白的提取分离实验中用的磷酸缓冲液（PBS)的目的？
利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血 红蛋白的正常结构和功能。便于观察（红 色）和进行材料的科学研究（活性）。
5.3血红蛋白的提取和分离
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可 以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖， 观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色 谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
(8)、结果
3、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳：
1.目的： 鉴定血红蛋白纯度。
2.试剂的配制：
①丙烯酰胺和N, N-亚甲基双丙烯酰胺: 用去离子水配制
29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-亚甲基双
丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水 配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶 的Tris缓冲液。④TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基 而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需 的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。 ⑦样品处理液： 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1% 的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液： 0.1%的考马斯亮蓝R250， 40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋 酸。
1.血液样品的处理 分层明显→样品处理完成 2.凝胶色谱柱的装填 放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡 聚3糖.血—红20蛋00白或的红分色离葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功。 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离 成功。
血红蛋白的提取及分离
“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织人民教育出版社课程教材研究所吴成军东北师范大学附属中学赵伟涛“血红蛋白的提取和分离”是人教版选修模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，因此，学生的学习兴趣很高。
下面结合人教版教材对该实验进行分析并提出相应的教学建议。
1.习得实验原理和方法1．1 初步获取血红蛋白的原理和方法（样品的处理和粗分离）实验步骤实验目的实验原理操作方法结果判断①洗涤红细胞获取较纯净的红细胞通过离心将密度不同的物质分离低速离心，去除上清液，反复加生理盐水并离心直到上清液未呈现黄色为止②释放血红蛋白破裂红细胞，释放血红蛋白低渗溶液中红细胞破裂；甲苯溶解膜脂，加速细胞破裂（相似相溶原理）加蒸馏水，再加甲苯，磁力搅拌器充分搅拌无明显现象③分离血红蛋白溶液初步得到血红蛋白溶液通过离心将密度不同的物质分离离心（较高速）试管溶液分为4层④透析去掉液体中的小分子物质小分子物质容易透出透析袋透析（12小时）透析袋中物质的颜色更红1．2 分离纯化蛋白质的原理与方法──凝胶色谱法（分子筛效应）凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。
而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。
分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
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课题: 血红蛋白的提取和分离
制作:段建慧审阅:李亚平时间:2010.2
目标导引
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
问题导学
阅读“基础知识”回答下列问题
1、回忆分离生物大分子的基本思路是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？
2、什么是凝胶色谱法？它分离蛋白质的原理是什么？
请据图阐述用凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程？
3、什么是缓冲溶液？缓冲溶液的作用是什么？缓冲溶液如何配制？
在血红蛋白提取和分离的整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
4、什么电泳？利用电泳实现样品中各种分子分离的原理是什么？常用的电泳方法是什么？在测定蛋白质分子量时通常用哪种电泳方法？原理是？
阅读“实验操作”回答下列问题
5、蛋白质提取和分离的步骤是？是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
6、用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？
请阅读教材，认识哺乳动物血液组成？血红蛋白的组成和功能是？
7、在进行样品处理时需要进行哪些操作？
8、红细胞洗涤的目的是什么？
红细胞的洗涤过程为？
洗涤干净的标准是什么？洗涤次数过少会怎么样？
加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
9、用什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
10、红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。
怎样除去这些杂质呢？结果？
11、透析的目的是什么？原理？透析袋的作用是什么？
12、说出制作色谱柱需要的材料？色谱柱的制作过程？
13、说出色谱柱的装填过程？
色谱柱的填料要经过怎样的处理？
色谱柱的装填的要求及其原因？
色谱柱制作成功标志是？
14、样品加入和洗脱的基本过程是？15、判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度鉴定，在鉴定方法中使用最多的是？
分层导练
课堂基础训练
1．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是（）
A．分子的大小B．相对分子质量的大小
C．带电荷的多少D．溶解度
2．利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是（）
A．相对分子质量大的B．溶解度高的
C．相对分子质量小的D．所带电荷多的
3. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（）
A. 糖类化合物
B. 脂质
C. 蛋白质
D. 核酸
4．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个( )
5．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质( )
A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快
C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快
6．缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的( ) A．温度B．pH C．渗透压D．氧气浓度
7．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为( )
A．H2 CO3一NaHCO3缓冲液B．NH4OH—NH4Cl缓冲液
C．CH3 COOH—CH3 COONa缓冲液D．H3PO4缓冲液
8．蛋白质提取和分离分为哪几步( )
A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳
B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
9．使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于( ) A．电荷的多少B．分子的大小C．肽链的多少D．分子形状的差异
10．洗涤红细胞的目的是( )
A．去除血清B．去除杂蛋白C．除去血小板D．除去水
11．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应( )
A．先打开后关闭B．关闭C．先关闭后打开D．打开
课后拓展训练
12. 下列操作正确的是（）
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心
B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h
13．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是( )
A．先加入1 mL透析后的样品B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出
C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功
D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水
14．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是( ) A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C．防止血红蛋白被02氧化
D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
15 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（）
A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
16. 凝胶色谱法操作正确的是（）
A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B. 将橡皮塞下部切出凹穴
C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
17. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）
A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
18. 下列说法不正确的是（）
A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌
B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体
C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物
D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液19．下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，不正确的是( ) A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞
B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。
C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白
D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来
20、下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有
A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞
B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质
C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA
D．蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化。