DNA重组技术
DNA重组及重组DNA技术
特点
分子水平操作和细胞水平表达 定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种
克隆(clone) 是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
重组DNA技术的目的 ① 克隆特定基因 ②序
重组DNA技术操作流程图
ACC ACC ACC ACC
AAG AAA AAG AAA
TAC TAC TAC TAC
TTT TTT T TC T TC
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
说明：由于密码存在简并性，合成出来的DNA可能与基因组DNA有所差异，此 问题可通过基因测序解决。如果是为了获得表达产物蛋白质，这种差异也 无所谓。
载体 目的基因
双酶切产生粘性末端
带有与载体 相同粘性末端
重组DNA分子
转化或转染
含重组载 体的细菌
对细菌进 行培养
操作过程可形象归纳为
分 ─ 目的DNA的分离获取 选 ─ 载体的选择与构建 接 ─ 目的DNA与载体的连接 转 ─ 重组DNA转入受体细胞 筛 ─ 重组体的筛选与鉴定
对克隆菌进行筛选、 鉴定和扩增
第二十一章 DNA重组及重组DNA技术
重组DNA技术(recombinant DNA technology)：
又称分子克隆或DNA克隆或基因工程技术，其主要过程包括：在体外 将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组 DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大 量拷贝。在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽 的制备以及基因结构的定向改造。
说明：这种cDNA中不包含内含子， 便于在宿主细胞中表达,适用 于真核生物基因。
S1核酸酶
AAAAAAAA(n) 3 TT T T T TT T (n) 5
DNA重组技术的基本工具
DNA重组技术的基本工具DNA重组技术是一种重要的分子生物学技术，用于改变基因组中的DNA序列，使之具有特定的功能。
这项技术的应用范围广泛，可以在基础研究、医学诊断、药物开发等领域发挥重要作用。
DNA重组技术的基本工具包括DNA片段的制备、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒和载体等。
首先，DNA片段的制备是DNA重组技术的第一步。
通过PCR（聚合酶链反应）或限制性内切酶切割，可以从某个DNA源中获取特定的DNA片段。
PCR是一种体外扩增技术，可以将特定的DNA序列进行快速放大。
限制性内切酶是一类特殊的酶，可以识别特定的DNA序列并在该序列上切割DNA链。
通过PCR和限制性内切酶的组合应用，可以制备出需要的DNA片段。
其次，限制性内切酶是DNA重组技术中的重要工具之一。
限制性内切酶可以特异性地切割DNA链，并产生一定的粘性或平滑的DNA末端。
这些末端的特性决定了DNA片段连接的方式。
常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。
当两个DNA片段具有相同的限制性内切酶切割位点时，它们可以通过限制性内切酶的连接来形成一个新的DNA分子。
接下来，DNA连接酶也是DNA重组技术中必不可少的工具之一。
DNA连接酶能够将两个DNA片段在适当的条件下连接在一起。
常用的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和DNA聚合酶。
通过合适的实验条件和适当的连接酶，可以使两个DNA片段有效地连接成为一个整体。
此外，质粒和载体也是DNA重组技术中的重要工具。
质粒是一种小环状DNA分子，在细菌细胞中存在，并能自我复制。
载体则是质粒或其他DNA分子，用于携带所需的DNA片段。
通过将需要插入的DNA片段连接到载体上的限制性内切酶切割位点上，并将该载体转化至宿主细胞中，就可以实现外源DNA的导入。
在实际应用中，DNA重组技术的基本工具往往是共同配合使用的。
通过PCR或限制性内切酶的组合，可以制备出所需的DNA片段；通过限制性内切酶的连接和DNA连接酶的应用，可以将不同的DNA片段连接起来形成一个新的DNA分子；通过质粒和载体的应用，可以将需要插入的DNA片段导入到宿主细胞中实现转化。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
第十三单元 重组DNA技术
【执业】1．限制性内切酶是一种
A.核酸特异的内切酶
B. DNA特异的内切酶
C.DNA序列特异的内切酶
D.RNA特异的内切酶
E.RNA序列特异的内切酶
答案：C
【执业】2．限制性内切酶的作用是
A.特异切开单链DNA
B.特异切开双链DNA
C.连接断开的单链DNA
D.切开变性的DNA
E.切开错配的DNA
答案：B
二、发展新药物
利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。目前已经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素、因子VIII、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子及白血病抑制因子等。
三、DNA诊断
DNA诊断又称基因诊断，目前已发展成为一门独具特色的诊断学科——DNA诊断学。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因的置换、缺失或插入等突变。目前用于DNA诊断的方法很多，但其基本过程相似：首先分离、扩增待测的DNA片段，然后利用适当的分析手段，区分或鉴定DNA的异常。目前广泛用于待测基因的分离及扩增技术是PCR技术，其次是连接酶链反应。常用的DNA分析手段有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、核酸分子杂交、变性梯度胶电泳、核酸酶A技术以及DNA序列分析等。
五、遗传病的防治
受累疾病基因克隆不仅为医学家提供了重要工具，使他们能深入地认识、理解一种遗传病的发生机制，为寻求可能的治疗途径、预测疗效提供了有力手段；更重要的是可以利用这成果进行极有意义的产前诊断，而后通过治疗技巧与治疗、预防能力的结合，从根本上杜绝遗传性疾病的发生和流行。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-1
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。
重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA 重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。
DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。
这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。
作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。
重组DNA技术
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。
表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位
• 4.诊断疾病 基因诊断是一种使用DNA分析技术来检测和鉴定出疾病的方法。利用重组DNA技术，可以制造出一 些特定的探针或引物，用于检测和分析DNA序列的异常和变异。例如，肿瘤细胞或乳腺癌细胞中常常伴随着某些基 因的改变，可以利用重组DNA技术制备出一些与变异基因相对应的探针或引物，用于检测和诊断疾病。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接， 提高重组效率。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性，都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点 的序列可知、固定。
通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
重组DNA技术
限制性核酸内切酶三种切口
❖ 产生5′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：
5′---G AATTC---3′ 3′---CTTAA G---5′ EcoR I
（五）DNA聚合酶（DNA polymerase）
重组DNA技术概述
❖重组DNA技术的基本概念 ❖重组DNA技术的基本步骤 ❖重组DNA技术中应用的重要工具 酶
一、重组DNA技术的基本概念
❖ 重组DNA技术(recombinant DNA technology) ：
是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
代完全相同的子代群体。
二、重组DNA技术的基本步骤
❖ 分—载体和目的基因的分离 ❖ 切—限制性内切酶 ❖ 接—载体与目的基因连接成重组体 ❖ 转—基因序列转入细胞 ❖ 筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定
以及表达产物的检测
. Plasmid vectors containing a polylinker, or multiple-cloning-site sequence, commonly are used to produce recombinant plasmids carrying exogenous DNA fragments. (a) Sequence of a polylinker that includes one copy of the recognition site, indicated by brackets, for each of the 10 restriction enzymes indicated. Polylinkers are chemically synthesized and then are inserted into a plasmid vector. Only one strand is shown. (b) Insertion of genomic restriction fragments into the pUC19 plasmid vector, which contains the polylinker shown in (a). (The length of the polylinker in relation to the rest of the plasmid is greatly exaggerated here.) One of the restriction enzymes whose recognition site is in the polylinker is used to cut both the plasmid molecules and genomic DNA, generating singly-cut plasmids and restriction fragments with complementary sticky ends (letters at ends of green fragments). By use of appropriate reaction conditions, insertion of a single restriction fragment per plasmid can be maximized. Note that the restriction sites are reconstituted in the recombinant plasmid.
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
DNA重组及重组DNA技术
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目录
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等
基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
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重组体DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
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目录
片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲 本DNA。
拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双 链区的两侧来自不同亲本DNA。
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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目录
分类：酶的组成、所需因子及裂解DNA的方 式 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用：
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
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目录
命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
第十五章 重组DNA技术
Blue-white screening on medium with ampicillin, X-gal and IPTG. white colonies contain recombinant plasmid and can be isolated directly from this plate
• DNA诊断 • 基因治疗
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DNA诊断 DNA Diagnosis
• DNA 诊断常用方法 PCR、限制性片断长度多态性、单链构象多 态性、限制性酶切图谱及基因测序等 • DNA诊断的应用 杜氏肌营养不良(DMD)、Leber遗传性神经 病、苯酮酸尿症
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基因治疗 Gene Therapy
• 基因治疗的概念 从基因水平调控细胞中缺陷基因、修补矫正 或替代缺陷基因，分为基因增补、替换、修 复三种类型。
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质粒
• 细菌染色体外、自主复制、闭合环状 DNA • 分子量1kb到200kb以上 • 带有特殊的遗传信息 “抗药性”等 • 改造后成为极其常用的载体 穿梭载体
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pUC19 map
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第二节 重组DNA基本步骤
• • • • • 目的基因的获得(分) 载体的选择与修饰（切） DNA分子的体外重组（接） 重组DNA分子的导入、鉴定（转，筛） 目的基因的表达（表）
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目的基因的表达 Expressing a Target Gene
• 外源基因在原核细胞的表达 优点：简单、迅速、经济适合大规模生产 缺点：缺乏转录后、翻译后加工机制 • 目的基因在真核细胞的表达 表达产物更接近真核天然蛋白质结构 表达载体既含原核克隆载体的主要元件， 又含各种真核表达元件
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第三节 重组DNA技术在医学中的应用
动物基因工程—DNA重组技术及步骤
基因的概念及其结构
2、基因的结构
非编码区
基因的结构（真核细胞）
编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
与RNA聚酶 结合位点
外显子
内含子
终止子
外显子: 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子: 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA
基因的概念及其结构
2、基因的结构
-100～-80
定的性状。 2、基因是有遗传效应的DNA片段，每个DNA分子上有许多个基因。所谓遗传效
应是指具备发育、表现出某性状的信息。 3、基因位于染色体上呈线形排列，染色体是基因的载体。 4、基因的脱氧核苷酸的排列顺序包含着遗传信息，对于某个基因来说其脱氧核苷
酸的排列顺序是固定不变的，而不同的基因的脱氧核苷酸的排列顺序又是不同的。 5、线粒体和叶绿体中的DNA分子上也有基因。 6、一个基因有两条单链，但只有其中一条含有遗传信息。
第二章
基因的概念及其结构
1、基因概念及其发展 2、基因的结构 3、基因工程的操作步骤
基因的概念及其结构
1、基因概念及其发展
基因概念经过了一个历史发展过程，并正 在继续发展和逐渐完善之中。
基因的概念及其结构
1、基因的概念及其发展 1865年
奥地利孟德尔
01
8年豌豆 杂交试验 02
提出： 遗传因子概念
03 总结： 两大遗 传定律
基因的概念及其结构
1、基因的概念及其发展 1909年
丹麦约翰逊
遗传因子
基因
基因的概念及其结构
1、基因的概念及其发展 1910年
美国摩尔根
基因位于染色体上并呈线性排列的 “念珠模型”，提出连锁互换规律。
生物技术制药-DNA重组技术
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
ＤＮＡ分子的体外连接 目标DNA片断插入载体
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片 段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间 形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮ Ａ分子的连接是在酶切反应获得同种酶 互补序列基础上进行的。
植物细胞 动物细胞 微生物细胞：细菌和真菌
（1）将目的基因导入植物细胞 双子叶植物—农杆菌转化法
（1）将目的基因导入植物细胞 单子叶植物—基因枪法
（1）将目的基因导入植物细胞
转基因抗虫棉－花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞
显微注射法
（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞
质粒转化法：
用CaCl2处理大肠杆菌细胞 感受态大肠杆菌细 胞 重组载体与之混合 重组载体感染感受态 细胞（目的基因进入大肠杆菌细胞）
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质 粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前 者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法
载体DNA分离的一般程序
载体DNA
感染或转染细胞（病毒型）
转化细菌细胞（质粒型）
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
DNA重组技术的优劣与伦理问题
DNA重组技术的优劣与伦理问题随着科技的发展，DNA重组技术在许多方面得到了广泛的应用。
然而，这种技术也带来了一些伦理问题。
本文将探讨DNA重组技术的优劣以及所涉及的伦理问题。
优势DNA重组技术的优势主要体现在以下几个方面。
一是疾病治疗。
人类的原始基因组中存在一些致病基因，例如突变的癌症基因等。
使用DNA重组技术，科学家们可以将这些致病基因替换为正常的基因，从而治疗疾病。
二是农业生产。
DNA重组技术可以使农作物变得更加抗病、耐旱、耐寒等，提高产量和品质，同时减少对资源的依赖和对环境的污染。
三是生物科学研究。
通过DNA重组技术，科学家们可以精确地编辑基因组，研究基因功能、基因表达、基因变异等现象，进而推动生命科学的发展。
四是工业生产。
例如，DNA重组技术可以用于合成人类胰岛素、人类生长激素等重要的生物制品，以及合成各种化学品。
短板然而，DNA重组技术也存在一些短板。
一是安全性问题。
对于人类体细胞的基因编辑，可能会存在一些副作用，甚至有可能导致癌症等恶性疾病。
此外，如果人类精子或卵子的基因组被编辑，可能对下一代产生不可逆的影响。
二是伦理问题。
通过DNA重组技术，我们可以“设计”出具有某些特定特征的人类。
这显然会引起一些伦理上的争议。
例如，基因编辑可能会导致优生学的崛起，即一些父母会选择编辑胚胎的基因，使其生下具有某些特定特征的孩子。
这是否符合道德和伦理标准，需要我们深思熟虑。
三是技术不可逆性问题。
一旦我们编辑了基因组，就很难再回到原来的状态了。
这可能会导致我们失去了某些重要的遗传信息，进而影响我们对基因组的理解和研究。
四是社会问题。
DNA重组技术可能会引起社会不平等。
如果只有一些人可以承担高昂的基因编辑费用，这就会导致社会贫富差距的进一步加剧。
此外，基因编辑也可能会导致一些种族歧视和基因歧视的问题。
伦理问题以上提到的伦理问题，都需要我们进一步的讨论和思考。
我们需要更加深入地探讨这些问题，制定出相应的道德和伦理规范，以确保DNA重组技术在应用时不会违反基本的道德原则，保护人类的尊严和价值。
DNA重组技术(DNA Recombination)
DNA重组技术(DNA Recombination)一、DNA 的酶切与连接（1）酶切反应：同质粒DNA 的鉴定，只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。
若大量酶切，则成比例增加。
（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（3）15000rpm离心15min，弃上清。
（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5）加入适量1×TE溶解。
如此可得线性化载体DNA 。
（6）测定DNA 的含量。
（7）加入线性载体DNA 和含量3～4倍于载体的待插入DNA 片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9）关于待插入DNA 片段的获得参见附注。
二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化1、感受态的制备（1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。
（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2、重组DNA 的转化（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：转化项目受体菌DNA 总体积DNA 对照组0 10μl200μl受体菌对照组200μl0 200μl转化组190μl10μl200μl（2）冰浴30min至1h。
中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3）42℃90s。
（4）37℃水浴5min。
（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
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6.置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时，酶切 过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的 酶切体系各组分浓度改变过大; 7.置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶 灭活条件可能不同，请参照说明书进行; 8.进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; 9.反应体系： 10×内切酶缓冲液 2l ＤＮＡ 1-1.5g 限制性内切酶 2-5单位 用灭菌的ddH2O补至20l，37℃ 1小时。可根据需要按 比例放大。
1、ＤＮＡ分子的体外连接 、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段 组邻的５’端磷酸与３’ 组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成 磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子 的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列 基础上进行的。
连接反应中值得注意的几个问题： 连接反应中值得注意的几个问题：
二、转化 １．在１. １．在１.５ml Eppendorf管中加入２００l感受态细 Eppendorf管中加入２００l感受态细 胞和１０l 胞和１０l ＤＮＡ （４０ng）溶液， 温和混匀，于 （４０ng）溶液， 冰上３０分钟。 ２．于４２℃ ２．于４２℃水浴９０秒。 ３．冰浴２分钟。 ４．加入８００l LB液体培养基 ４．加入８００l LB液体培养基 ３７℃ ３７℃４５分钟。 ５．取２００l涂布于含Amp(５０g/ml)琼脂糖平皿， ５．取２００l涂布于含Amp(５０g/ml)琼脂糖平皿， ３７℃ ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
1.ＤＮＡ连接酶 1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ＤＮＡ连接酶作用机制
Ｔ４连接酶作用分三步： １.Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成 酶－ＡＭＰ复合物。 ２.酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸 基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ 腺苷化。 ３.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
五.注意事项
影响限制性内切酶活性的生物因子： 影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性 质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、 EDTA、甘油等）；
内切酶用量不超过总反应体积的10%； 消化时间适当延长有利于提高酶活性； 加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用； 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性； 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用； ＤＮＡ样品应不含重金属离子
实验试剂
ＬＢ培养基 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 CaCl2 0.1M Amp
实验方法
一、感受态细胞制备 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16~20 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16~20 小时。 ２．挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃ ２．挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃振荡过 夜。 ３．从中取２ml菌液转入50mlＬＢ培养基中37℃ ３．从中取２ml菌液转入50mlＬＢ培养基中37℃振荡培 养4~5小时， 测ＯＤ600达0.4~0.5。 4~5小时， 0.4~0.5。 ４．培养物于冰上１０分钟。 ５．转入50ml离心管，于4000rpm下 ５．转入50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10分钟。 离心10分钟。 ６．弃上清，倒置离心管1 ６．弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余残液然后加入 10ml用冰预冷的 10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上10分钟。 ，置冰上10分钟。 ７．4,000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。 ７．4,000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。 ８．加入2ml， ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。 悬浮细胞，于4
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
2.连接反应的温度 2.连接反应的温度
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃ 定，折衷方法是１２℃过夜。
3. ＤＮＡ的平末端和粘性末端 ＤＮＡ的平末端和粘性末端
由于内切酶产生的ＤＮＡ末端有平末端和粘 性末端，因而连接反应中就有平未端连接和 粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
结果与分析
电泳检查连接结果： 如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提 高连接效率。
ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
实验目的及背景： 实验目的及背景： 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的 重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重 组的阳性克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在 生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目 的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所 不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的， 不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研， 医药生产和生物发酵等领域。
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温 中与外来ＤＮＡ分子相混合. 中与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌 表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链 进入受体菌，另一条降解； ３．自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内 复制成双链； ４．表达－－供体基因随同复制子同时复制， 分裂， 转录翻译。
连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。
实验试剂
１．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０× ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ＤＮＡ连接酶buffer 200mM TrisTris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500g/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ４．5mM ATP
胶回收注意事项
将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜 配制的灭菌电极缓冲液； 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以 减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。
ＤＮＡ的连接 ＤＮＡ的连接
在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相 同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ 连接酶的作分三步： T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP ATP -AMP 复合物。 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟 基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
第四部分 ＤＮＡ重组技术
－－ＤＮＡ的酶切、 －－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化 的酶切
ＤＮＡ的酶切反应 ＤＮＡ的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列 （4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特 有的粘末端或平端。
一、实验目的
掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法
重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１.抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带 有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉 霉素等）这样只有转化子才能在含该 抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。 本实验利用抗生筛选转化子。
２.互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大 肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β 肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基 因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。 因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。 这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当 外源基因插入时，二者溶为一体后，有β 外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷 酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β －Ｄ－半乳糖苷（x gal）培养基中形成兰色菌落。 －Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失 活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色 不同而区分重组子和非重组子。
酶切反应 1.设计酶切体积为20~30l，计算清楚酶切系统中 各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下 进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后， 分装； 2.先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积 的10x酶切缓冲液，混匀； 3.在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； 4.加入适量的ＤＮＡ样品； 5.弹匀，短暂离心；
二、实验原理
1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的 一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的 核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的 免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现 已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方 式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮ Ａ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切 酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而 在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基 化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技 术中收到广泛应用。