环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间_剂量_效应观察

文章编号:1006-446X(2006)08-0027-05

环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的

时间、剂量-效应观察

王文蔚方芳李春明

(温州医学院公共卫生学院,浙江温州325035)

摘要:为研究环磷酰胺(CP)诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间-效应关系和剂量-反应关系,

给小鼠一次腹腔注射不同剂量(按体质量计)CP(0、30、60、90mg/kg)后,于不同时间(给药后12、

24、36、48、60h)、不同部位(胸骨与股骨)取材来观察小鼠骨髓细胞微核率的变化。结果表明,高、

中、低三个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<

0101),且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),并表现出明显的剂量-反应关

系;不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响具有统计学意义(P<0105),在36~48h这个时

间段能够观察到更高的微核率,通过线性回归的曲线拟合分析,以41h取材最佳;胸骨取材与股

骨取材之间的微核率差异无统计学意义(P>0105)。环磷酰胺可作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳

性对照,在一定范围内,具有剂量-反应关系和时间-效应关系。给小鼠一次腹腔注射量(按体质量

计)60~90mg/kg后36~48h胸骨取材可取得较高微核率,结果满意。

关键词:微核;环磷酰胺;骨髓;小鼠

中图分类号:R446119文献标识码:A

微核试验是反映染色体损伤的一种重要试验方法,它具有简易、快速、灵敏、准确的特点,因而得到广泛的应用,在食品、药品、农药、环境等多领域的化合物毒理学安全性评价中起到重要作用,是必做的试验之一[1]。本实验以环磷酰胺为诱变剂,观察给药剂量、取材时间及取材部位对小鼠骨髓细胞微核率的影响,为微核试验的标准化和最佳实验方案提供依据。

1材料与方法

111材料、仪器与试剂

环磷酰胺(上海华联制药有限公司,批号:041103),用生理盐水配制;小牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司,批号:20031219),灭活后使用。

显微镜(Leica),普通离心机。

甲醇(分析纯),pH618的磷酸盐缓冲液,1B9Giemsa染色液。

112动物分组与处理

选用ICR小鼠80只(温州医学院实验动物中心提供,合格证号SYXK(浙)2005-0061),体质量18~25g,雌雄各半。称质量,编号,随机分为4组(剂量均按体质量计):零剂量组(0mg/kg,也可称阴性对照组),低剂量组(30mg/kg),中剂量组(60m g/kg),高剂量组(90mg/kg),每组20只,

收稿日期:2006-04-20

按10mL/kg腹腔注射给药(0mg/kg剂量组用生理盐水代替),随后再将每组动物随机分为5小组,每组4只,分别于给药结束后12、24、36、48、60h用颈椎脱臼法处死、取样。

113取样方法与处理

对中剂量组每只小鼠均取胸骨与股骨两个不同部位的骨髓制作涂片,其余三个剂量组则只取胸骨骨髓制作涂片。胸骨取材,选取骨髓相对较多的两节胸骨,清理干净,剪断,挤出骨髓于滴有小牛血清的玻片上,混匀,制成细胞悬液推片;股骨取材则分离一侧股骨,剔除干净,剪断两端骨骺,用015~1mL小牛血清冲洗骨髓腔至115mL离心管中,1000r/min离心5min,弃上清液后摇匀推片。晾干后两种骨髓片均用甲醇固定15min,Giemsa染色13min,然后冲洗、晾干、镜检。

114观察计数与统计方法

采用双盲法阅片,每张片子计数1000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes,简称PCE),记录含有微核的嗜多染红细胞数(micronucleated polychromatic erythrocytes,简称MNPCE),规定PCE 中出现多个微核的按一个计算,计算微核率(j)。统计方法采用SPSS1210软件及STATA610软件进行统计分析处理。

2结果与分析

211不同剂量、不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响

结果见表1。经两因素析因设计方差分析,不同剂量与不同取样时间两个因素对小鼠骨髓细胞微核率的影响没有交互作用(F=01972,P=01485,P>0105),但它们各自的单独效应(对小鼠骨髓细胞微核率的影响)均有统计学意义(P<01001)。组间比较经LSD-t检验后发现,高、中、低各个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<01001),而且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),表现出明显的剂量-反应关系。不同时间取样点经两两比较,36、48h取材时间点与其他几个取材时间点的差异有统计学意义(P<0105),表明36~48h这个时间段能够观察到更高的微核率。

表1不同剂量、不同取样时间的小鼠骨髓细胞微核率比较(n=4)单位:j

组别

取样时间/h

1224364860

零剂量组(0mg/kg)1125?11261150?11292150?11291175?01961150?1173低剂量组(30mg/kg)8150?213810125?117113150?218914150?316911150?2108中剂量组(60mg/kg)11125?313015125?219818150?218919100?313715150?4120高剂量组(90mg/kg)12175?315017150?216520175?317721150?318717125?4135

212给予不同剂量环磷酰胺后不同时间取样的小鼠骨髓细胞微核率变化趋势

在本实验条件下,随着处理剂量的增加,小鼠骨髓细胞微核率相应升高,显示出良好的剂量-效应关系;同时随着取样时间的变化,小鼠骨髓细胞微核率也显现出逐渐升高、达到高峰、然后下降的变化过程,表现出明显的时间-效应关系,见图1。