环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间_剂量_效应观察
小鼠骨髓细胞微核试验
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。
ห้องสมุดไป่ตู้
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
三、实验材料
小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
小鼠腹腔注射阿霉素诱导骨髓细胞微核率的最佳时间—剂量效应分析
Ｌｓ Ｄ０ 值为 ２ ．４ ｇｋ ， ５ 的可信 限为 ２．４ — ４９ １ｍ ／ ｇ ９ ％ １２ １
２ ． ７ ／ ｇ ９ ２ １ｍｇｋ 。而 在 本 实 验 中 ，笔 者 用 １ ％ Ｌ 、 ０ Ｄ
染 色体损 伤 方便 、快 速 的方 法 ，是 遗 传毒 理 实 验 常 用 的细胞 遗传 学 方 法 之 一 Ｊ 。所 以 目前 许 多 国家 （ 区 ） 和 国 际组 织 都 将 其 视 为评 价新 药 、食 品 添 地
第２ ３卷
第 ２期
文 山学 院学 报
Ｊ ＵＲＮ Ｆ Ｗ Ｅ ＨＡＮ Ｕ Ｖ Ｓ Ｔ Ｏ ＡＬ ０ ＮＳ ＮＩ ＥＲ Ｉ Ｙ
Ｖｏ． ３ Ｎｏ ２ １２ ．
２１ ０ ０年 ６月
Ｊｎ ２ １ ｕ．００
小 鼠 腹 腔 注 射 阿霉 素 诱 导 骨 髓 细 胞 微 核 率 的 最 佳 时 间一 剂 量 效 应 分 析
染 色单体 行 动滞 后 ，不 能进 人 子 细胞 的主 核 ，而 形
成 了一组 微核 ，这 样 形 成 的微 核 体 积 往 往略 大 于 一 般 典型 的微核 。 由于微 核 的产 生与染 色 体和 Ｄ Ａ损 Ｎ
伤 有较大 关 系 ，故 常将微 核 的检 出率作 为 Ｄ Ａ损 伤 Ｎ
中最重要的因素是用药剂量和采样 观察 时间等¨ 引，
因此 ，笔 者设计 了本试 验 来 检 测 阿霉 素 诱 发 产生 微 核 的最佳 时 间和剂量 。在 笔者 － 面 的实验 中 ，得 】 纠前 到 了阿 霉 素腹 腔 注 射 昆 明 种 小 白 鼠 的 半 致 死 剂 量
的一种 指标 … 。微 核实 验 创建 于 ２ ０世 纪 ７ ０年 代 中
五味子粗多糖拮抗环磷酰胺诱导小鼠微核的实验研究
作者简 介： 王艳杰 （９３ ， ， １ 一）女 讲师 ， ７ 现为黑龙 江 中医药 大学 ２Ｏ 级 ０４
中药学专业博士研究生 ， 研究方 向： 中药抗肿瘤机理研究。
收稿 日期：０６ ５—１ ２０ —０ ４
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中医药信息 ２０ 年第 ２ ０６ ３卷第 ５期 表 １ 五 昧子 多糖 对 Ｃ 诱导小 鼠骨髓嗜 多染红细胞微核的影响 Ｐ
维普资讯
Ｉ Ｃ ． ｅ ． Ｏ ６， Ｔ Ｍ Ｓ ｐ ２ Ｏ Ｖｄ． ３， ２ ＮＯ． ５
五味子粗 多糖拮抗环磷酰胺诱 导
小 鼠微 核 的实验研 究 ＊
王艳杰 ， 勃岩 ， 吴 梁颖
（ 黑龙江中医药大学 ， 哈尔滨 黑龙江 １ ００ ５ ４） ０
１ 实验 材料 １ １ 实验动 物 ．
昆明种小 鼠由黑龙江 中医药大 学动物饲 养室提
供。 １２ 药品与仪器 ． 五味子 由本院门诊部药材部购买 。五味子多糖 的
提取 ： 取干燥成熟的五味子果实 ， 碾碎 ， 沸水浸泡 ， 用水 连续提取 ， 浓缩 ， 乙醇沉淀多次 ， 除蛋 白、 除氨基酸、 干 燥制得 。环磷酰胺 ， 由上海华联制药公司生产。秋水 仙素 、 一Ｂ Ｕ Ｓ Ｍ ５ ｒ ，Ｉ Ａ公司生产 。Ｋ Ｌ 甲醇、 ｄ Ｇ Ｃ、 冰醋酸 均为分析纯。尼康显微镜。 ２ 实验 方 法 ２１ 五味子粗多糖的提取 ． 参照杨婷婷［方法并修改。五味子果实 ， ］ 干燥 ， 碾 碎， 用沸水浸泡过夜 ， 微沸 ｌ ， ４ ｈ用 层纱布过滤 ， 次所 ３
基金项 目： ＊黑龙江中医药 大学基金项 目（０４８ ２０ １）
得 的滤液混合后 ， 浓缩 ， 抽滤。用 ５ 倍的无水乙醇醇沉 ２ ｈ反复抽滤 ４次 ， ４， 滤液用正丁 醇和氯仿去蛋 白质等 杂质 ， 并进行氨基酸和蛋白质 的检测 ， 无氨基酸或蛋 白 质后 ， 进行干燥处理（ｏｃ ， ６ｏ）制成颗粒或粉末。根据实 验 的需 要 ， 用蒸馏 水 配成 不 同的剂量 。 再 ２２ 小 鼠骨髓 嗜多染 红细胞 （Ｃ ） ． Ｐ Ｅ 微核 试验 选 取 ２ ２ｇ昆 明种小 鼠 ５ ０ ２ ０只 ， 雄 各 半 ， 机 雌 随 分为 ５ ， 组 每组 １ 只 。阴性对照组（ ０ 生理盐水 ） 阳性 、 对照组（ 环磷酰胺 ， ｍ ／ｇ和 ３ ４ ｇｋ） 个五味子多糖剂量组 ０ （０ ｇｋ、０ ｇｋ 、０ ｇｋ ） 阴性 对 照 组 和 剂 量 组 ４ｍ ／ｇ ２ｍ ／ｇ １ｍ ／ ｇ 。 第 １ ８ 分别腹腔注射生理盐水、 ｄ 五味子多糖。阳性 对照组第 ｌ ６ 腹腔注射生理盐水 ， ｄ 于第 ７８ 腹腔注 、ｄ 射环磷酰胺 ， 于第 ８ 注射环磷酰胺 ６ 后 ， ｄ ｈ 颈椎脱臼法 处死试验动物。取其双侧股骨 ， ７ ％乙醇浸泡的纱 用 ５ 布剔除肌肉， 剪断肌骨 ， 以生理盐水 冲洗骨髓细胞 ， 常 规制片、 每只小鼠涂 ３ 张片子 ， 并编号 ， 自然凉干 ， 甲醇 固定 ，：Ｇｅ ｓ染 色、 １９ ｉ ａ ｍ 油镜观察。每 只动物计数 １０ ００ 个 嗜多染红细胞 ， 并记录出现微核细胞数 ， 采用双侧 ｔ 检测进行两样本均数 比较 ， 计算抑制率 。 抑制率 ＝［阳性组出现数 一 （ 试验组出现数） 阳性 ／ 组 出现数 ］ ０％ 。 Ｘ１０ ３ 结 果 ３ １ 五味子粗多糖的提取 ． 采用上述方法提取的五味子多糖呈现深褐色颗粒 或淡褐色粉末 。每 ｌ 五味子可获得 １ｍ 的五味子粗 ｇ ８ｇ 多糖。 ３２ 五昧子粗多糖的微核试验的结果 ． 五味子多糖各剂量组对 ｃ 诱 导的小 鼠骨髓 Ｐ Ｅ Ｐ Ｃ 微核率均有抑制作用。与阳性对照组 比较， 差异非常 显著（ Ｐ＜００ ） ．１ 。其 中在 ２ｍ ／ ｇ ４ｍ ／ｇ ０ ｇｋ 和 ０ ｇｋ 时拮抗 作用最强 ， 抑制率为 ４ ． ％和 ４ ． ％。见表 １ ８９ ８ ８８ ２ 。该 结果表明， 五味子多糖具有抑制微核率增加的作用。
余甘子抗突变和抗肿瘤作用实验研究
・
３５ ・ ４６
塞旦 匡堇鍪圭 ！ ９ 月第 １ ４卷第 ２ 期 （ ５ 旬刊 ） ＪＭ ， ｅ ｅ ｂｒ２Ｈ ，ｏ １ Ｎ０ ２ （ ｓｕ Ｐ Ｔ ＳＮ ｍ ｅ＿ ０７Ｖ １ ４ ． ５ Ｉｓ ￣ ０ ．
，
Ｅ ｅｙ ｅ ａ ｖ ｒ ｎ Ｄ Ｔ
微核 实验 和睾丸染 色体 畸变实验观 察余甘 子的抗 突变作 用， Ｓ一１０和 Ｈ一２ 以 ８ ２移植 性肿 瘤观 察余甘子 的抗肿 瘤效 果。结果 ： 余甘子对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核发 生和 丝裂 霉素诱发 的小鼠睾丸 细胞 染 色体 畸变均有 明显的 抑制效果 ； Ｓ一１０和 Ｈ一 ２小鼠移植性 肿瘤生长也有 明显的抑制作 用。结论 ： 对 ８ ２ 余甘子对体 细胞 和生殖 细胞 的 Ｄ Ａ Ｎ 损伤均有保 护作用 ， 对小鼠移植性肿瘤也有一定 的抑瘤作 用。 ［ 关键词］余甘子 ； 微核 ； 肿瘤 ； 突变 抗 ［ 中图分类号］Ｒ ７ ． ［ ９ ９ １ 文献标识码 ］Ａ ［ 文章编号 ］６ １ ９ （０７）５３ ５ ￣２ １ ７ ￣０ ８ ２ ０ ２ － ６ ４
１ 材 料 与方 法
１２ ３ １ 余 甘子对 Ｓ一１０小 鼠抑 瘤试 验 雄性 昆明种小 ．．． ８ 鼠， 体重 ２ ０ ｇ～２ 。实 验动 物 随机 分为 阳 性对 照组 和高 、 ５ｇ 中 、 ３个剂量组 ， 低 每组 １ ２只动物 ， 甘子各组 剂量 同小 鼠骨 余 髓 细胞微核试验 。经 口灌 胃， 胃第 １ 灌 ３天 ， 在无 菌条 件下 ， 于 右侧腋 窝皮 下接 种 Ｓ一１０肿 瘤细 胞 悬液 ５×１ 细 胞 ０ ２ ８ ０ ． ｍ， ｌ接种后继续余甘 子灌 胃，１ｄ后 ， １ 颈椎脱 臼处死小 鼠， 取出 瘤体称重 。结果采用单 因素方差分析统计处理 。 １２ ３ ２ 余 甘子对 Ｈ一２ ．．． ２小 鼠抑瘤 试验 雄 性 昆 明小 鼠， 体重 ２ ～２ ， ０ｇ ５ｇ 动物分组 和剂量 同小 鼠骨髓细 胞微 核试 验。 经 口灌 胃， １ 第 ３天在无菌 的条件下 ， 右侧腋 窝皮下 接种 Ｈ 于 ２ 肿 瘤细胞 ５×１。 ２ ０ 细胞 ０ ２ｍ ， 种后继续余 甘子灌 胃， ． ｌ接
3.小鼠骨髓细胞微核试验
Giemsa染色时网织红细胞呈蓝灰色，称为多染红细胞；而成熟红细 胞染色呈橘红色，称为正染红细胞。
三.实验步骤 1.染毒：昆明种小鼠，环磷酰胺100mg/kg腹腔注射。 2.骨髓液制备和涂片：颈椎脱臼处死动物。解剖后取胸骨或股骨， 去除肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤出或冲洗出，滴于载玻片推片。 3.固定：晾干后甲醇固定15秒，取出晾干。 4.染色：晾干后以新鲜配制的Giemsa染液染色5-10分钟，自来水冲 洗，晾干。 5.观察计数：低倍镜选择分布均匀、染色较好的区域，油镜下观察 计数。含有微核的PCE/1000个PCE；PCE/NCE。
实验三 小鼠骨髓多染红细胞微核试验
重庆医科大学实验教学管理中心 公共卫生实验原理 3.掌握镜下辨认微核的技术
二.实验原理： 细胞分裂过程中在染色体断裂剂或纺锤体毒物作用下，细胞染色体 断裂产生不含着丝粒的断片，或者整条染色体遗失在细胞质中，形 成微核。 染色与主核一致，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，圆形或椭圆 形，一个或多个。 在多种细胞中出现。 在红细胞成熟前组后一次分裂后数小时主核排除而微核保留。
红细胞发育过程： 骨髓多能干细胞→定向干细胞→原红细胞→早幼红细胞→中幼红细 胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞 从原红细胞到晚幼红细胞需分裂3-4次。形成晚幼红细胞后即不再 分裂，在发育过程中主核排出形成网织红细胞。网织红细胞含有少 量RNA，甲酚蓝染色成蓝色丝网状。网织红细胞进一步发育，RNA消 失成为成熟红细胞。
四.结果分析与评价 1.PCE/NCE比值约为1（0.6-1.2）。比值小于0.1表明PCE生成严重 受抑制，染毒剂量过大。 2.用统计方法分析结果。 五.实验成功的关键 1.制作良好的骨髓涂片 2.优质的染色
微核试验
5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇 固定15分钟，取出晾干
3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储 备液一份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10－ 15分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干
四 观察和计数：
１ 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，
再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红 细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形， 边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以 出现一个或多个微核。
4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后 期（微核形成期），末期
图13-1 细胞周期可划分为四个阶段
微核（micronucleus）
是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体 受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在 细胞质中，末期后，单独形成一个或几个规则的 次核，包含在子细胞用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞 质中
2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向 移动，从而遗留在细胞质中
结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生 的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗 传学终点
微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中 难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数 PCE细胞中的微核，因为在此阶段，主核排出，易 于观察微核，这些细胞保持其嗜碱性约24小时， 然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。
图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400）
微核 嗜多染细胞
注意事项：
小鼠骨髓细胞微核试验
操作步骤
• 1.取材：实验动物最后一次染毒后，按确定的时间将 小鼠颈椎脱臼（大鼠断头）处死后，剪取一侧股骨， 剔净肌肉，用纱布擦掉附在股骨上的血液和肌肉，剪 掉股骨头，露出骨髓腔。用带７号针头的注射器吸取 小牛血清（小鼠需１ml，大鼠需２ml），插入骨髓腔
微核。
试验设计
• 1.动物选择 一般常用的实验动物为大、小
鼠。以小鼠用的最多，要求体重18-20g，
7-12周龄。每组小鼠数量10只，雌、雄各
半。
试验设计
• 2.染毒途径 根据研究目的或受试化学毒物
性质不同，可分别选用经口、经皮、经呼
吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可
能采取如人接触化学毒物相同的途径。
原 理
• 微核试验是用于检测染色体损伤和干扰细
胞有丝分裂的化学毒物的快速方法。微核
是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，
大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或
杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细
胞中可以出现一个或多个。
原 理
• 一般认为微核使细胞内染色体断裂或纺锤
丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细
10min。如当日不染色，也需固定好保存。
• 4.染色：片子固定后，滴加瑞氏-姬姆萨A溶液于涂
片上，让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟；再将
B溶液滴加于A液上面（滴加量为A液的2~3倍），
以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液
充分混合，染色8分钟；水洗、干燥、镜检。
• 注意：（不要把细胞冲洗掉）
胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检
测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体
环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的时间毒理学研究
环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的时间毒理学研究
张杰;吴萍
【期刊名称】《首都医科大学学报》
【年(卷),期】2002(023)004
【摘要】@@ 目前,外源性化学物质与机体生物节律间的相互关系的研究,已引起人们的注意[1],而对于环磷酰胺(CP)引起的小鼠体细胞遗传损伤是否与生物节律有关的报道较少.
【总页数】1页(P346-346)
【作者】张杰;吴萍
【作者单位】首都医科大学环境卫生与劳动卫生学教研室;首都医科大学环境卫生与劳动卫生学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R1
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绞股蓝对环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核形成的抑制作用
（ ｅａｔ ｅｔ ｆ ｉ ｏｙ Ｃ Ｈ ｇ ｆ ａｉ Ｍ ｄｃ ｅ Ｈｕｅ Ｕ ｉ ｒ ｔ ｏ ｈｎｓ ｄｃｎ ，Ｗｕ ａ ３ ０５ ｕ ｉ Ｄ ｐｒ ｎ ｏ ｏ ｇ ， ｏ ｅｅｏ ｓ ｅ ｉｎ ， ｂｉ ｎ ｅｓｙｆ Ｃ ｉｅ Ｍｅｉ ｅ ｍ Ｂｌ Ｂ ｃ ｉ ｖ ｉ ｅ ｉ ｈｎ４０ ６ ，Ｈ ｈ ） ｅ
定的保护作用。 关键 词 ： 股 蓝 ； 诱 变 环磷 酰 胺 ； 核 绞 抗 微
中图分类号 ：２ ５ ５ １ ）３０ １ －３ １０ －８ Ｘ（ ００ ０ －０ ９０
Ｈｅ ｂ ｎ ｓｅ ｅ ｏ ｎ ｉｉｎ ｏ ｍａ ｉｎ ｏ ｃ ｒ ａ Ｇｙ ｏ ｔ ｍａ ｎ Ｉ ｈｂｔ ｇ Ｆ ｒ ｔ ｆＭｉｅ ｉ ｏ Ｂｏ ｅ Ｍａ ｒ ｗ ｉｒ ｎ ｃｅ ｕ ｅ ｙ Ｃｙ ｌｐ ｏ ｐ ａ ｄ ｎ ｒ ｏ Ｍ ｃ ｏ ｕ ｌ ｉ ｎ ｃ ｄ ｂ ｃｏ ｈ ｓ ｈ ｍｉｅ Ｉｄ
龙再慧， 倪娅 ， 刚 赵
（ 湖北 中医学 院医学 生物学教研室 ， 湖北 武汉 ４０ ６ ） ６ ０ ５
摘要 ： 目的 了解 中药绞股蓝拮抗 常用化疗 药物环 磷酰胺诱 发小 鼠骨髓 细胞微 核形成 的作用及 其剂量 效应。方
法 将绞股蓝水煎液接低、 高三种剂量（ ．７ ／ ｇ２ ３ ｇ ｋ 、 ．５／ ｇ 分别对腹 注环 磷酰胺 的三个 实验组小 鼠进 中、 ０ ７ ｇ ｋ 、．０ ／ ｇ６ １ ｓｋ ） 绞 股
ｍｉｅ ｂ ｎ ｒｏ ｅｌ ｎ ｔ ｄ ｓ ｆ ｃ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｈｅ ｂ ｙ ｏ ｔ ｍａ ｅ ｏ ｔ ｎ ｏ ｗ，ｍｅ ｉ ｍ ｄ ｈ ｏ ｅ ｅ ｅ ａ ｍ ｎ ｓｅｅ ｎ ｃ ｏ ｅ ｍａ ｒ ｗ ｃ ｌ ａ ｄ ｉ ｏ ｅ ｅ ｅ ｔ ｓ ｓ ｔｏ ｓ ｒ ａ ｇ ｎ ｅ ｅ ｄ ｃ ｃ ｉ ｆｌ ｓ ｏ ｏ ｄ ｕ ａ ｉｈ ｄ ｓ ｓ ｗ ｒ ｄ ｎ ｓ ｉ ｉ ｒ ｉ ｔｄ
环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制模型及中药对其防治作用机制研究进展
环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制模型及中药对其防治作用机制研究进展作者：王成龙赵东峰杨志烈贾友冀常君丽王拥军杨燕萍来源：《世界中医药》2017年第09期摘要化疗后骨髓抑制容易导致患者发生感染或出血，严重影响患者治疗、预后和生命质量，甚至危及生命，给患者及家属带来很大痛苦。
中医药防治化疗导致骨髓抑制越来越受到重视。
随着骨髓抑制动物模型的建立、应用和成熟，中药防治化疗导致骨髓抑制机制的研究也取得许多进展，显出中药治疗的优势和前景。
关键词环磷酰胺；化疗；骨髓抑制；小鼠模型；机制研究Mouse Model of CyclophosphamideInduced Myelosuppression and Research Progress on Mechanism of Action of Chinese Meteria Medica in its treatment and preventionWang Chenglong1，2，Zhao Dongfeng1，Yang Zhilie1，3，Jia Youji1，4，Chang Junli1，Wang Yongjun1，Yang Yanping1（1 Spine institute，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China； 2 Central Laboratory for Research，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China； 3 Integrated Chinese and Western Medicine College，Binzhou Medical College，Yantai 264003，China；4 Department of Orthopedics，Ruijin Hospital，Shanghai JiaoTong University Medical School，Shanghai 200025，China）AbstractPatients with chemotherapyinduced myelosuppression is prone to infection or bleeding，which has a serious impact on their treatment，prognosis and quality of life and even endangers life and leads patients and their family to suffering.In recent years，traditional Chinese medicine in preventing and treating chemotherapyinduced myelosuppression have gradually garnered increasing attention.As the animal model of myelosuppression is being established，applied and mature，research on mechanism of Chinese meteria medica in preventing and treating chemotherapyinduced myelosuppression has made great achievements，showing the advantages and prospect of Chinese meteria medica in the treatment of this disease.Key WordsCyclophosphamide； Chemotherapy； Myelosuppression； Mouse model； Study of Mechanism中图分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.064化疗是肿瘤治疗的重要手段，骨髓抑制是化疗最常见的不良反应，严重影响化疗进行，使临床疗效降低。
小鼠骨髓细胞微核试验
动物骨髓细胞染色体畸变分析
目的和意义:
1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型
染色体畸变：
指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的 改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞 有丝分裂中期的染色体来发现
染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为 细胞遗传学实验
注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
流程图
处死小鼠，取胸骨
图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ）
注意事项：
低渗是本实验的关键，控制好低渗时 间，做出分散良好的染色体标本，关系到 实验结果的准确性
流程图
处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中 期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg
补肾生血药干预不同时间对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠细胞周期与细胞增殖的影响
世界中西医结合杂志２０２１年第１６卷第２期 ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０２１，Ｖｏｌ １６，Ｎｏ ２ ·实验研究·ＤＯＩ：１０．１３９３５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｊｚｘ．２１０２１９基金项目：国家自然科学基金面上项目（８１７７４１７６）作者单位：１．首都医科大学中医药学院中医基础学系，北京１０００６９；２．首都医科大学附属北京天坛医院中医科，北京１０００７０；３．首都医科大学附属北京佑安医院病理科，北京１０００６９通信作者：王文娟，Ｅｍａｉｌ：ｒｕｙｕｅ９９９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ补肾生血药干预不同时间对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠细胞周期与细胞增殖的影响刘开江１ 王文娟１ 贾春蓉２ 岳竹君３ 马 １【摘要】 目的 观察补肾生血药干预不同时间对环磷酰胺诱发骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期及细胞增殖的影响。
方法 ５２只雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、补肾生血药低剂量组、补肾生血药高剂量组。
先预防用药３ｄ，补肾生血药低剂量组、高剂量组灌胃不同剂量补肾生血药，其余组灌胃蒸馏水。
第４～６天造模，除空白对照组腹腔注射生理盐水外，其余组均腹腔注射环磷酰胺。
造模同时进行干预，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子，其余组给药同预防用药，分别持续到造模后第１０天、第１２天、第１４天。
收集小鼠骨髓细胞，流式细胞仪检测１０ｄ、１２ｄ、１４ｄ骨髓细胞周期，１２ｄ、１４ｄ骨髓细胞ＣＤ３４＋率；造血祖细胞培养法观察１０ｄ、１４ｄ红细胞集落形成单位（ＣＦＵ－Ｅ）、爆式红细胞集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅ）、粒细胞－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）数量。
结果 细胞周期分析，１０ｄ时造模各组明显阻滞在Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期（Ｐ＜０．０１），补肾生血药低剂量组则明显阻滞在Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ２／Ｍ期（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；１２ｄ时细胞周期阻滞解除，各组间比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；１４ｄ时补肾生血药高剂量组明显由Ｇ０／Ｇ１期进入到Ｇ２／Ｍ期（Ｐ＜０．０５）。
1,3-二苯-1,3-丙二酮对环磷酰胺诱导骨髓微核的预防保护作用
1,3-二苯-1,3-丙二酮对环磷酰胺诱导骨髓微核的预防保护作用刘晓晓;贾凤兰;阮明;张宝旭【摘要】目的研究1,3-二苯-1,3-丙二酮(1,3-diphenyl-1,3-proanedione,DPPD)对环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核的保护作用和对小鼠骨髓细胞微核的影响.方法40只小鼠随机分为8组,分别为阴性对照组,环磷酰胺阳性对照组,环磷酰胺+DPPD 低、中、高剂量组(62.5,250,1000 mg/kg),DPPD低、中、高剂量组(62.5,250,1000mg/kg),每组各5只.DPPD各剂量组小鼠经口给药30 d,每天1次.环磷酰胺采用30 h经口灌胃染毒.第2次染毒6h后,小鼠麻醉脱臼处死,检测小鼠骨髓细胞微核率(千分率).结果与阴性对照组比较,环磷酰胺阳性组小鼠骨髓细胞微核率明显升高(P＜0.01),DPPD剂量组小鼠骨髓细胞微核率变化不明显(P＞0.05);与环磷酰胺阳性组比较,环磷酰胺+DPPD低剂量组(62.5 mg/kg)小鼠骨髓细胞微核率变化不明显(P＞0.05),环磷酰胺+DPPD中、高剂量组(250、1000 mg/kg)小鼠骨髓细胞微核率明显降低(P＜0.01),微核抑制率分别为35.58％和61.54％.结论30 d经口给予DPPD对小鼠骨髓细胞微核率没有影响,DPPD对环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核具有一定的预防保护作用.%Objective To study the protective effect of 1,3-diphenyl-1,3-proanedione (DPPD) on bone marrow micronucleus induced by cyclophosphamide and the effects of DPPD on bone marrow micronucleus in mice.Methods Forty mice were divided eight groups randomLy,which were control group,cyclophosphamide positive control group,DPPD (62.5,250,1000 mg/kg) combined with cyclophosphamide groups,DPPD (62.5,250,1000 mg/kg) groups with 5 rats in each group.DPPD was administered orally once a day to theexperimental groups for thirty days and Cyclophosphamide was administered by oral perfusion.The anesthetized mice were killed after the second administration to 6 hours and then examined the rate of bone marrow micronucleus.Results Compared with the control group,only the micronucleus rate of cyclophosphamide group increased obviously (P ＜0.01),and the micronucleus rates of DPPD groups had no significant pared with the cyclophosphamide positive control group,even though the micronucleus rate of the low dose group of DPPD (62.5 mg/kg) combined with cyclophosphamide didn't change obviously,the micronucleus rates of the middle and high dose groups of DPPD (250、1000 mg/kg) combined with cyclophosphamide increased obviously (P ＜ 0.01),and the inhibition rates of bone marrow micronucleus were 35.58％ and 61.54％ respectively.Conclusion DPPD shows no impact on bone marrow micronucleus after singly administering DPPD orally thirty days,but DPPD can antagonize the bone marrow micronucleus inducing effect of cyclophosphamide in mice.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2013(010)023【总页数】3页(P13-14,17)【关键词】1,3-二苯-1,3-丙二酮;环磷酰胺;微核;保护作用【作者】刘晓晓;贾凤兰;阮明;张宝旭【作者单位】北京大学公共卫生学院毒理学系国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室,北京 100191;北京大学公共卫生学院毒理学系国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室,北京 100191;北京大学公共卫生学院毒理学系国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室,北京 100191;北京大学公共卫生学院毒理学系国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室,北京 100191【正文语种】中文【中图分类】R446.191，3-二苯-1，3-丙二酮（1，3-diphenyl-1，3-proanedione，DPPD），是存在于甘草根中的一种β-二酮类物质[1]，研究发现其具有化学防癌[2-4]、抑制DNA及蛋白质损伤、抗氧化[5]、抗炎症等多方面的功效。
熟地黄多糖对环磷酰胺诱导小鼠的抗突变作用研究
熟地黄多糖对环磷酰胺诱导小鼠的抗突变作用研究梁颖;徐绍娜;徐放;李明珠;黄寅炎;吴勃岩【摘要】目的:探讨熟地黄多糖的抗突变作用.方法:采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠骨髓细胞姐妹染色单体交换试验方法评价熟地黄多糖的抗突变作用.结果:熟地黄多糖对环磷酰胺诱导的小鼠微核率、染色体畸变率、姐妹染色单体交换率具有抑制作用.结论:熟地黄多糖具有抗突变活性.【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2010(027)004【总页数】3页(P110-112)【关键词】熟地黄多糖;微核试验;染色体畸变试验;姐妹染色单体交换试验【作者】梁颖;徐绍娜;徐放;李明珠;黄寅炎;吴勃岩【作者单位】黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学,黑龙江,哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5地黄为玄参科植物地黄(Radix Rehmanniae PreParata)的新鲜或干燥块茎。
熟地黄是生地的炮制品，是中医常用的补肝肾、益精血之品，具有补血滋阴、益精填髓的功效，是优良的滋阴补血药，被誉为“壮水之主，补血之君”，广泛用于阴虚、血虚所致的各种疾病。
多糖是地黄中有效成分之一，有资料表明，熟地黄多糖具有抗氧化，抗衰老［1］，增强机体免疫功能等作用［2，3］。
但关于熟地黄多糖在抗突变方面的文献的报道还很少。
本实验通过三种常用的抗突变试验，研究熟地黄多糖的抗突变作用，为其进一步研究提供依据。
1 材料方法1.1 实验动物昆明种小鼠，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。
1.2 药品与试剂熟地黄(购于同仁堂);熟地黄多糖(由本实验室提取并鉴定);环磷酰胺(上海华联制药有限公司);秋水仙素(上海国药集团化学试剂有限公司);5－BrdU(南京探求生物技术有限公司)。
环磷酰胺剂量_取样时间对小鼠骨髓微核率的影响_肖凯
比值与对照组的比较差异均无统计学意义, 提示小鼠一次腹腔注射 40 mg/ kg 和 80 mg/ kg CP 后对骨髓细胞无明显抑制作用。80 mg/ kg CP 剂量组各时间点上的微核率显著高于 40 mg/ kg 剂量组, 表现出明显的剂量 _反应关系。 结论: 在本实验室条件下, 40 mg/ kg 和 80 mg/ kg CP 均可致小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核率显著增加, 具有剂量 _反应关系。在一次性腹腔注射环磷酰胺后 24 h 观察所 得微核率最高。故认为环磷酰胺可用作微核试验的阳性对照, 剂量范围为 40~ 80 mg/ kg, 给药后 24 h 取材最佳。
第 17 卷 第 6 期
5 O 11 月
癌变 畸变 突变
论著
Effe c ts o f Cy c lo p ho s pha m ide Do s e a nd S a m p ling Tim e o n M o us e M ic ro n uc le us Fre q ue nc y in Bo ne M a rro w
1. 3 试验方法 1. 3. 1 样本的收集和染色 溶剂对照组给药后 24 h, 剂量组给药后 18 、24 、48 h 用颈椎脱臼法处死小 鼠。选取一节相对较长的胸骨, 于靠近结节处间断, 暴露 胸骨腔, 用小号止血钳夹紧间断处和相邻结节处的胸 骨, 挤出骨髓涂于玻片上的小牛血清中, 用另一张干净 玻片推片, 置空气中自然干燥。将晾干的骨髓片放入染 色缸中, 用甲醇溶液固定 10 min, 取出晾干。将固定晾干 后的骨髓片, 用新鲜配制的 Giemsa 应用液 ( Giemsa 储备 液 1 份加 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲液 9 份) 在室温下染色 20 min, 然后冲洗掉玻片上的染色液, 置晾片架上晾干。 1. 3. 2 显微镜观察 先在低倍镜下进行观察, 选 择分布均匀, 染色较好的区域, 再在油镜下观察计数。多 染红细胞 ( Polychromatic erythrocytes, PCE) 呈灰蓝色, 正 染红细胞( Normochromatic erythrocytes, NCE) 呈桔黄色。 细胞中的微核多数呈圆形, 边缘光滑整齐, 嗜色性与核 质一致, 呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或 多个微核。 出现多个微核的 PCE 按一个计 算。计数
小鼠腹腔注射阿霉素诱导骨髓细胞微核率的最佳时间-剂量效应分析
小鼠腹腔注射阿霉素诱导骨髓细胞微核率的最佳时间-剂量效应分析常征【摘要】目的:寻找一次染毒条件下,腹腔注射阿霉素诱导小鼠骨髓细胞微核率出现峰值的时间-剂量条件.方法:将150只小鼠随机分为5组,每组30只,雌雄各半.腹腔注射,1次给药,对照组给生理盐水,处理组的阿霉素剂量分别是2.5 mg/kg、5mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg.染毒18 h、24 h、30 h 、48 h和72 h后取小鼠骨髓进行微核分析,评价阿霉素对小鼠的遗传毒性作用.结果:理想的腹腔注射诱导的小鼠骨髓细胞微核率峰值的条件就是:一次染毒,阿霉素剂量在10% LD50即2.5 mg/kg 至80% LD50即20 mg/kg的范围内剂量越大微核率越高,取样时间在30～48 h间微核率最高.【期刊名称】《文山学院学报》【年(卷),期】2010(023)002【总页数】5页(P108-112)【关键词】阿霉素;小白鼠;腹腔注射;微核率;时间-剂量效应【作者】常征【作者单位】云南师范大学,生命科学院,云南,昆明,650092;文山学院,生化系,云南,文山663000【正文语种】中文【中图分类】R979.11.1.1实验动物昆明种健康小白鼠,150只,体重 18～22 g,雌雄各半,[云南实验动物许可证:SCXK(滇2005 -0008)]。
购于昆明医学院动物试验中心。
1.1.2实验药品注射用盐酸多柔比星 (阿霉素),10 mg装,深圳万乐药业有限公司生产,产品批号:0808E1,生产日期:20080823。
氯化钠注射液,250 mL装,昆明南疆制药有限公司生产,产品批号:B081111h1,生产日期:20081111。
1.1.3实验药品的配制用 1 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL的注射器取生理盐水注射到 10 mg装阿霉素中配制成不同浓度,混匀后,用 1 mL的注射器吸取并腹腔注射小鼠。
1.1.4仪器设备日本奥林巴斯BX51系统荧光显微镜;800型离心机 (金坛市大地自动化仪器厂)。
取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细胞微核率的影响
取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细胞微核率的影响宫丽昆山;冯洁;屠曾宏【摘要】目的:比较一次给药后不同采样时间对鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率的影响.方法:ICR小鼠一次腹腔注射(IP)MMC 2.0 mg/kg.bw或CP 40mg/kg.bw, 后12 h、18 h、24 h、32 h、48 h、72 h采外周血及骨髓涂片,Giemsa染色,计数嗜多染红细胞及其微核数.结果:一次IP MMC或CP后12 h 即可观察到小鼠骨髓PCE微核率增高,分别在给药后24 h、32 h达到高峰,此后逐渐下降,到72 h已接近对照组水平;而外周血PCE微核率的显著增高则出现在给药后的24 h,在48 h达到高峰.结论:外周血PCE作为微核试验靶细胞与骨髓PCE的检测敏感性相同,但外周血PCE微核高峰出现较骨髓延迟约12～24 h;在检测化学物对骨髓细胞毒性方面,外周血与骨髓的检测灵敏性也相同.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2001(013)001【总页数】3页(P39-41)【关键词】微核试验;嗜多染红细胞(PCE);骨髓;外周血【作者】宫丽昆山;冯洁;屠曾宏【作者单位】中国科学院上海药物研究所;中国科学院上海药物研究所;中国科学院上海药物研究所【正文语种】中文【中图分类】Q343.2+45微核试验是反映染色体损伤的一种简易、快速的检测方法。
骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核率作为常规指标广泛应用于化学物的安全性评价及诱变剂的筛选。
但骨髓嗜多染红细胞微核试验亦存在某些局限,为此,人们尝试了多种靶组织或细胞的微核试验,其中外周血嗜多染红细胞(即网织红细胞)一直受到国内外学者的关注。
1997年ICH4已通过可以采用外周血为靶组织进行微核试验1。
但国内关于此方面的报道较少。
本实验应用丝裂霉素C及环磷酰胺两种致突变物,比较了一次给药后不同采样时间对小鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率的影响。
环磷酰胺对小鼠遗传和生殖毒性影响的研究(1)--对骨髓细胞微核和染色体的影响
环磷酰胺对小鼠遗传和生殖毒性影响的研究(1)--对骨髓细胞微核和染色体的影响贾庆军;郭魁亮;刘天鹏;冯长龙;杨录军;周燕虹【期刊名称】《白求恩军医学院学报》【年(卷),期】2006(004)001【摘要】目的探讨不同剂量的环磷酰胺对小鼠骨髓细胞微核和染色体的影响.方法骨髓细胞微核试验,40只小鼠随机分为4组,3个实验组分别腹腔注射环磷酰胺10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg,于染毒后24 h、48 h取小鼠胸骨髓,计数小鼠骨髓细胞微核率;骨髓染色体畸变试验,16只小鼠随机分为实验组和对照组,实验组小鼠腹腔注射环磷酰胺30 mg/kg,连续5 d染毒,第5 d染毒后6 h取双侧股骨骨髓,计数小鼠染色体畸变率,评价环磷酰胺对小鼠的毒性作用程度.结果小鼠腹腔注射环磷酰胺各剂量组骨髓细胞微核发生率显著高于对照组(P＜0.05);染色体畸变率亦高于对照组,且有非常显著性差异(P＜0.01).结论腹腔注射环磷酰胺可诱导小鼠染色体损伤.【总页数】2页(P6-7)【作者】贾庆军;郭魁亮;刘天鹏;冯长龙;杨录军;周燕虹【作者单位】050081,石家庄,白求恩军医学院;050081,石家庄,白求恩军医学院;050081,石家庄,白求恩军医学院;050081,石家庄,白求恩军医学院;400038,重庆,第三军医大学预防医学系卫生毒理教研室;400038,重庆,第三军医大学预防医学系卫生毒理教研室【正文语种】中文【中图分类】R979.1;R994.1【相关文献】1.环磷酰胺对小鼠遗传和生殖毒性影响的研究(2)--对雄性小鼠生殖细胞的影响 [J], 贾庆军;刘天鹏;郭魁亮;冯长龙;杨录军;周燕虹2.烹调油烟对小鼠骨髓细胞染色体畸变率和微核率影响的研究 [J], 让蔚清;李东阳3.环磷酰胺对小鼠骨髓细胞微核率的影响作用研究 [J], 王文蔚;方芳;李春明4.艾灸对环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核率的影响 [J], 魏明俊;叶卓明5.环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核的影响因素的研究 [J], 余明泽;刘以农;蒋中仁;谢惠萍;葛宇杰;敬明武;郭明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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文章编号:1006-446X(2006)08-0027-05环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间、剂量-效应观察王文蔚方芳李春明(温州医学院公共卫生学院,浙江温州325035)摘要:为研究环磷酰胺(CP)诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间-效应关系和剂量-反应关系,给小鼠一次腹腔注射不同剂量(按体质量计)CP(0、30、60、90mg/kg)后,于不同时间(给药后12、24、36、48、60h)、不同部位(胸骨与股骨)取材来观察小鼠骨髓细胞微核率的变化。
结果表明,高、中、低三个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<0101),且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),并表现出明显的剂量-反应关系;不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响具有统计学意义(P<0105),在36~48h这个时间段能够观察到更高的微核率,通过线性回归的曲线拟合分析,以41h取材最佳;胸骨取材与股骨取材之间的微核率差异无统计学意义(P>0105)。
环磷酰胺可作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳性对照,在一定范围内,具有剂量-反应关系和时间-效应关系。
给小鼠一次腹腔注射量(按体质量计)60~90mg/kg后36~48h胸骨取材可取得较高微核率,结果满意。
关键词:微核;环磷酰胺;骨髓;小鼠中图分类号:R446119文献标识码:A微核试验是反映染色体损伤的一种重要试验方法,它具有简易、快速、灵敏、准确的特点,因而得到广泛的应用,在食品、药品、农药、环境等多领域的化合物毒理学安全性评价中起到重要作用,是必做的试验之一[1]。
本实验以环磷酰胺为诱变剂,观察给药剂量、取材时间及取材部位对小鼠骨髓细胞微核率的影响,为微核试验的标准化和最佳实验方案提供依据。
1材料与方法111材料、仪器与试剂环磷酰胺(上海华联制药有限公司,批号:041103),用生理盐水配制;小牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司,批号:20031219),灭活后使用。
显微镜(Leica),普通离心机。
甲醇(分析纯),pH618的磷酸盐缓冲液,1B9Giemsa染色液。
112动物分组与处理选用ICR小鼠80只(温州医学院实验动物中心提供,合格证号SYXK(浙)2005-0061),体质量18~25g,雌雄各半。
称质量,编号,随机分为4组(剂量均按体质量计):零剂量组(0mg/kg,也可称阴性对照组),低剂量组(30mg/kg),中剂量组(60m g/kg),高剂量组(90mg/kg),每组20只,收稿日期:2006-04-20按10mL/kg腹腔注射给药(0mg/kg剂量组用生理盐水代替),随后再将每组动物随机分为5小组,每组4只,分别于给药结束后12、24、36、48、60h用颈椎脱臼法处死、取样。
113取样方法与处理对中剂量组每只小鼠均取胸骨与股骨两个不同部位的骨髓制作涂片,其余三个剂量组则只取胸骨骨髓制作涂片。
胸骨取材,选取骨髓相对较多的两节胸骨,清理干净,剪断,挤出骨髓于滴有小牛血清的玻片上,混匀,制成细胞悬液推片;股骨取材则分离一侧股骨,剔除干净,剪断两端骨骺,用015~1mL小牛血清冲洗骨髓腔至115mL离心管中,1000r/min离心5min,弃上清液后摇匀推片。
晾干后两种骨髓片均用甲醇固定15min,Giemsa染色13min,然后冲洗、晾干、镜检。
114观察计数与统计方法采用双盲法阅片,每张片子计数1000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes,简称PCE),记录含有微核的嗜多染红细胞数(micronucleated polychromatic erythrocytes,简称MNPCE),规定PCE 中出现多个微核的按一个计算,计算微核率(j)。
统计方法采用SPSS1210软件及STATA610软件进行统计分析处理。
2结果与分析211不同剂量、不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响结果见表1。
经两因素析因设计方差分析,不同剂量与不同取样时间两个因素对小鼠骨髓细胞微核率的影响没有交互作用(F=01972,P=01485,P>0105),但它们各自的单独效应(对小鼠骨髓细胞微核率的影响)均有统计学意义(P<01001)。
组间比较经LSD-t检验后发现,高、中、低各个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<01001),而且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),表现出明显的剂量-反应关系。
不同时间取样点经两两比较,36、48h取材时间点与其他几个取材时间点的差异有统计学意义(P<0105),表明36~48h这个时间段能够观察到更高的微核率。
表1不同剂量、不同取样时间的小鼠骨髓细胞微核率比较(n=4)单位:j组别取样时间/h1224364860零剂量组(0mg/kg)1125?11261150?11292150?11291175?01961150?1173低剂量组(30mg/kg)8150?213810125?117113150?218914150?316911150?2108中剂量组(60mg/kg)11125?313015125?219818150?218919100?313715150?4120高剂量组(90mg/kg)12175?315017150?216520175?317721150?318717125?4135212给予不同剂量环磷酰胺后不同时间取样的小鼠骨髓细胞微核率变化趋势在本实验条件下,随着处理剂量的增加,小鼠骨髓细胞微核率相应升高,显示出良好的剂量-效应关系;同时随着取样时间的变化,小鼠骨髓细胞微核率也显现出逐渐升高、达到高峰、然后下降的变化过程,表现出明显的时间-效应关系,见图1。
t/h图1不同剂量与不同取样时间下小鼠骨髓细胞微核率的变化213微核率随时间变化的曲线拟合方程用STATA610软件作线性回归分析,用各剂量组的微核率均数作二次拟合曲线,得各剂量组方程如下:¹零剂量组:y=011104x-010014x2(F=90197,P=010005,r2=019785)º低剂量组:y=016665x-010079x2(F=298187,P=0000,r2=019934)»中剂量组:y=019363x-010113x2(F=741152,P=0000,r2=019973)¼高剂量组:y=110677x-010130x2(F=752182,P=0000,r2=019974)。
通过计算,各剂量组微核率达到最大值的取材时间点分别为38136、42136、41131、40195h,均值为40175h。
在原始数据中加入(0,0)点,用各组均数和时间作图,并且规定拟合的曲线过(0,0)点,见图2。
t/h图2小鼠骨髓细胞微核率随时间变化的二次拟合曲线214不同取材部位对小鼠骨髓细胞微核率的影响经观察,胸骨和股骨骨髓涂片的嗜多染红细胞形态及染色情况无明显差别,其微核检出率及两者的差别见表2。
经配对t检验,胸骨和股骨微核率之间的差异没有统计学意义(P>0105)。
因采用胸骨骨髓制片更为简便易行,并可减少试验费用,值得提倡。
表2中剂量组不同部位取材的小鼠骨髓细胞微核率比较(n=4)单位:j编号取样时间/h1224364860胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨113111416151422211122891613181923182119396129221715121617415121915191318171416t(P)11849*(01162)11477*(01236)11665*(01195)11172*(01326)01577*(01604)*与股骨同时间取样组比较,经配对t检验,P>0105。
3讨论在微核试验中常用环磷酰胺为诱变剂作阳性对照,但由于影响骨髓微核率的因素较多,如小鼠品系、性别、年龄、给药方式和剂量、染毒途径和次数、取材时间和部位,以及制片、染色、检测方法等,其中,给药剂量和取样观察时间对小鼠骨髓微核率的影响较大,常造成各实验结果的不尽一致[2-4]。
由于不同化合物诱发微核出现的高峰时间不尽相同,波动范围可能在24~72h[5];而且同一化合物,如果给药剂量与途径不同,动物种属不同,微核率峰值出现的时间也不同[6-7]。
因此,合理选择给药剂量和取样时间对获取较高的微核率显得尤为重要,特别是当化学物致突变效应较弱时更有意义。
本次实验根据文献推荐的环磷酰胺剂量(50~100mg/kg)[5],采用4个剂量组别,5个取样时间,应用两因素析因设计方法来观察它们对小鼠骨髓微核率的影响,结果表明,剂量因素与时间因素对小鼠骨髓细胞微核率的影响均具有统计学意义(P<0105),并具有剂量-反应关系和时间-反应关系,通过线性回归的曲线拟合分析,发现给药后41h小鼠骨髓微核率达到高峰。
考虑到微核峰值的时效性,并且它的峰值不会很快升降,在其高峰前后12h采样均能高效检出微核[8]。
故建议:用环磷酰胺作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳性对照时,剂量(按体质量计)可选择60~ 90mg/kg,取样时间在给药后36~48h,采用一次腹腔注射、胸骨取材可取得较高微核率,结果满意。
参考文献:[1]曹佳.微核试验在中国的应用、发展与展望[J].遗传,2003,25(1):73-76.[2]沈其萍,杨萍,秦光汉,等.环磷酰胺诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核方法的探讨[J].中国食品卫生杂志,2000,12(4):17-19.[3]李彤,王金山,孙志刚,等.骨髓微核试验程序的探讨[J].卫生毒理学杂志,1993,7(3):180-182.[4]夏义武,程仁璋,黄芒莉.正交设计法研究环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核的影响因素[J].中国现代应用药学杂志,2003,20(2):89-91.[5]王心如.毒理学实验方法与技术[M].北京:人民卫生出版社,2003:70-71.[6]T ICE R R,EREXSON G L,HILLIARD C J,et al.Effect of treatment protocol and sample ti me on the freq uencies of m-icronucleated polychromatic erythrocytes i n mouse bone marrow and peripheral blood[J].Mutagenesis,1990,5(4): 313-321.[7]VANPARYS P,DEKNUD T G,VERMEIREN F,et al.Sampli ng times in micronucleus testing[J].Mutat Res,1992,282:191-196.[8]印木泉.遗传毒理学[M].北京:科学出版社,2002:410-415.Effect of Cyclophosphamide Treatment on the Frequencies of Micronucleated Polychromatic Erythrocytes in Mouse Bone MarrowW ANG Wenwei,FANG Fang,LI Chunming(School of Public Heal th,Wenzhou Medical College,Wenzhou325035,China)Abstract:To observe the time-and dose-effect relationship of cyclophosphamide treatment on the frequencies of micronucleated polychromatic erythroc ytes in mouse bone marrow,adult mice weighing18~25g were d-i vided into four groups(20per group),and were given introperitoneal injection of cyclophosphamide at doses of0,30,60,and90mg/kg respectively.Each group of mice was further divided into5subgroups(4each) and sacrificed at12,24,36,48and60h respec tively.Bone marrow was obtained from sterna and femur. The micronucleated polychromatic erythrocytes were counted and the frequencies of micronucleated polychro-matic erythrocytes calculated.The results sho wed that the difference in the frequencies of micronucleated poly-chromatic erythrocytes among the4different dose groups were statistical significant(P<0101).The frequen-cies of micronucleated polychromatic erythrocytes induced by cyclophosphamide are dose and time dependent with the highest frequency seen at36~48h with high doses.No statistical differences were seen between the bone marrow obtained from sterna or femur(P>0105).It c oncluded cyclophosphamide-induced micronu-cleated polychromatic erythrocytes in mouse bone marrow can be used as a positive control.The optimal results can be produced36~48h after introperitoneal injection of c yclophospha mide at the doses of60~90mg/kg. Key words:micronucleus;c yclophospha mide;bone marrow;mice。