各种细胞培养经验
PC12细胞的培养整理总结
一、PC12细胞的折光性本来就比较好，刚传代以及新分裂的细胞都是亮的，至于你说的贴壁的细胞，不知道是否是圆的，在牛血清的刺激下，特别是国产的，会使pc12细胞发生定向的分化，长突起，贴壁就比较牢。
PC12分为未分化的和分化的.前者是球状,成团生长;后者形成很多丝状体;而丁香园里有人说楼主的这种细胞严格来讲已经不能算是PC12了.前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰,查了一些资料,现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助!培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中,置于ＣＯ2培养箱(37℃,95%空气5%ＣＯ2),培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ,高糖),加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。
分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,直径15～20μｍ,也有椭圆或多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状(A图)。
分化后:加入ＮＧＦ后的24ｈ内细胞停止分裂,长出似交感神经元样的突起;第4～14ｄ,细胞体积增大,突起增多并增长,形成网络,数周后,突起可长达500～1000μｍ(B图)。
NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能[12]。
分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍二、我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。
1.我用的是15％的马血清和%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。
2.关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。
多聚就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白，这种刺激作用还涉及到MAPK途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。
相关的文献可以自己到pubmed上查找。
3.完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突起断裂，细胞存活率很低。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞培养心得
养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。
关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。
1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。
这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。
有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。
这种一般是属于生长速度慢的细胞。
譬如内皮细胞。
而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。
尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。
并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。
如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。
所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。
2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。
这个其实是有一个方法可以改善的。
对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。
这时侯再开始正式的消化、吹打。
（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。
10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。
选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml 新培养基再轻轻洗一次。
然后加入完全培养基培养。
后续观察细胞生长情况以及形态。
我称之为“二传”。
呵呵。
如果一次效果还不理想，可重复多次。
直到找到细胞完美形态。
其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。
喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。
反之亦然。
这个是我师兄发明的，谢谢他了。
细胞培养心得
目录293和293T293T细胞的培养心得293T细胞的培养与传代Jurcat细胞的传代悬浮细胞培养方法Jurcat细胞培养方法293T细胞的培养心得点击次数： 12 发表于：2008-08-24 23:25转载请注明来自丁香园来源：丁香园293T细胞差点被我养死，幸好我又将它起死回生，一点心得。
细胞传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80％时就要传代，一传二，24小时后再传代。
48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80％，应该换新的培养基，不然，培养基变黄，细胞脱落。
细胞消化：将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清），混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。
如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml 的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞完全消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。
培养基：MEM(GIBCO)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋双抗293T细胞的培养与传代点击次数： 24 发表于：2008-08-25 20:47转载请注明来自丁香园来源：丁香园293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。
我的293T细胞时老板从美国千里迢迢带回来的，当时正是冬天，老板把瓶子放在大衣口袋里在飞机上折腾了两天，等拿到实验室已经看不到贴壁的细胞了。
细胞培养的注意事项
相关疾病:每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢？早走早脱身，从此专注黑生物1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
2。
不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
4。
水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换（灭菌水加进去）.5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。
6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。
非科班出身经验分享1. 别怕浪费。
枪头什么的只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上，离一段距离。
2。
动作要既轻柔又有力。
动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来。
. 刚开始的时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡.后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来,留一点,枪的最头部尽量深的在液面以下。
3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手.4。
实验结束后对实验台的消毒.紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。
5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。
比如实验台，又比如培养箱内部。
6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定.培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次.细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。
大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰；该使劲的时候绝对不含糊,不该使劲的地方一定忍住。
如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。
如果是高级台子就多用酒精喷喷。
感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。
最后一点点绝对非科班的经验。
癌细胞真是坚挺。
有一次实在是不想传了，放了 5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了.抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。
293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
细胞培养心得
1、寄运细胞或者接收细胞，都要做好充足的准备;如果是让其它实验室寄运细胞，或者寄给别人细胞，细胞应该如何处理是主要考虑的问题。
假设细胞在途中要经过48小时，那么可以待细胞长到50%的密度时处理细胞，即将细胞培养瓶内加满培养液，拧紧瓶盖，用封口膜封紧瓶口；然后将培养瓶放进泡沫盒，用纸或泡沫将盒内空间填满，使培养瓶不能随意移动。
同时将泡沫盒钻上几个孔，使空气可以流通。
因此要确定准备好以下物品：透气的细胞培养瓶；封口膜；足量的培养液；放细胞培养瓶的泡沫盒及填充物；除了细胞的处理，还要注意以下几点：1）提前跟快递公司人员联系，要上门取货（大多快递公司都可以，顺丰确实算是好些；近来觉得韵达速度也很快）2）时间安排（细胞处理尽量安排在下午，因为快递公司一般来说都是晚上统一发货，要是早晨处理细胞交给快递公司，细胞还没上路呢，就已经在培养箱外待了一天）；接收细胞就容易多了，提前准备好细胞培养用耗材及培养用液就可以了，紫外灯先打开，收到细胞将培养瓶中大部分培养液吸掉，留下4-5ML培养液（针对25cm2的培养瓶）；培养一天后，观察细胞状态，确实是传代还是换液。
总而言之，运送细胞讲究两点：1离开了培养箱要防止被污染2尽量缩短细胞不在培养箱的时间，不然时间过久细胞长满脱落就没得救了。
2要讲的是MTT试验，这个纯粹讲个人经验，因为我本身的考虑可能就是错的，所以非常欢迎提出疑问以及批评指正。
1）细胞的铺板：以96孔板为例，做细胞实验的同学看文献可能注意到，有较多的文献中提到细胞接种数量是5000个/孔；最初我也是按照这个数量来铺板的，实际上这个接种数量偏高；假设给药时间是48小时，发现空白对照孔中会有细胞无法贴壁，因为太满了，被挤出来了。
如此，则会因为接种密度原因，而不能准确反映细胞的正常生长情况及给药组作用情况。
即使是给药时间为24小时，仍然会出现类似情况。
因此，我后期实验中接种细胞数量为3000-4000，如果是药物作用48小时，最好是3000cells/每孔，空白对照孔细胞在加MTT前也就刚好长满，后来才发现别人也很多按照这个数量接种的，只是提醒需要注意，不要盲目的按照5000这个密度，还有的是100，基本上不靠谱。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
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HePG2细胞和L-02细胞的传代：HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株，L-02细胞则是人胎肝细胞株，二者所使用的培养基可以是一样的，即最常见的DMEM。
一干使用低糖的。
细胞长满培养瓶时既要传代。
使用胰酶消化即可。
用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。
使用前37度预热，细胞经PBS 清洗两遍后，每个中号培养瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。
加入胰酶以后，为使酶的活性最大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。
如果在室温情况下消化，时间相应加长，可以在显微镜下观察，当细胞界限已十分清楚，即已分离为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。
16HBE细胞株的传代方法：镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。
常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。
25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。
20分钟后开始传代。
先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，然后加0。
25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。
反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，分至3个新的培养瓶中，补足培养液。
将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。
次日观察。
胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养：细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.AAV-293细胞的传代:AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态最好.用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.肺癌细胞（人类），其中绝大部分都是贴壁细胞，具体如：（１）Ａ５４９（肺腺癌）（２）ＮＣＩＨ４４６（小肺细胞癌）（３）８０１（非小肺细胞癌）（４）ＮＣＩＨ４６０（大细胞肺癌）在消化传代过程中，步骤基本一致：吸去旧的培养液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一两次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ１０％ＦＢＳ）．注意：吹细胞时尽量多吹边角儿，此处细胞生长的多．另外吸出细胞前要混匀．另注：消化液的配制方法：Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Naprepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS.小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）：吸弃原培养液-->PBS洗一两次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->吸弃trypsin后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸钙-->吸打（枪的吸力调至最小），1：10接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%CO2 ,37度）MDBK（牛肾细胞）类型：贴壁细胞来源：购自武汉病毒所细胞保存中心由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存传代步骤：弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长细胞特点:该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到80%,48h不传就会变的很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBK还是很好传的,比以前我传的ST、Vero细胞等要好传一些，且不那么容易死亡，所以是我的一个比较好的选择！该细胞适合接种疱疹病毒（如：伪狂犬病毒）！BHK-21：弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落-------赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。
但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染，如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。
补充一点关于BHK-21的培养,先用少量胰酶冲洗一下,弃去,再用胰酶消化1min左右,效果会好一些皮肤成纤维细胞和THP-1细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。
THP-1细胞是悬浮的。
由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。
先说皮肤成纤维细胞。
当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。
一般十天左右传一代。
先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。
加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。
吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。
因为血清可以终止胰酶的消化。
然后吹打瓶底各处使细胞脱落。
再分瓶补加培养液。
THP-1细胞的传代就比较简单了。
可以有两种传代方法。
如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就可以采用直接传代法。
传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。
吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。
如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。
如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂质。
如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。
离心后去除上清液，加入新的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。
目前的方法就这些，希望对新手有所帮助BHK－21的经验：吸出培养基，吸得越干净越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培养箱消化。
是否需要用hanks 或pbs 之类得缓冲洗细胞并不绝对必要，我都没有洗，感觉应该洗一下更好，但也更麻烦并增加了污染得可能性。
如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。
胰酶在使用前最好预热到37度。
由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，我的经验是将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热。
消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK－21还是比较好消化的，5－15min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。
可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血亲灭活。
一般在T－25瓶中留7－8ml培养基培养。
在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。
如果使用的培养基偏碱最好先放在CO2培养箱中平衡。
细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂），如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多，此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。
几种乳腺癌细胞的培养：我养的细胞都是乳腺癌细胞，就是以下几种，1、MCF-7：是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml 吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。
需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。
2、T47D：也是一种人乳腺癌细胞，培养基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培养方法与MCF-7差不多，但这种细胞传代时间长了会极难养。
我曾养过一株新从美国购置的，两三天传一代，长得很旺。
后又从国内购买一株时间较长的，要七天传一代，而且很娇气。
3、MA891 鼠乳腺癌细胞：这种细胞比较特殊的是很难消化，容易消化成一团一团的，如果胰酶的量比常用的多三分之一充分预热并放入培养箱中消化就会好的多。
传到15－20代细胞就易长成团，从此生长缓慢，形态改变，需要复苏重养。
95-D细胞的传代:首先要把0.25%的胰酶和培养液在37度水浴20~30分钟(预热).从培养箱中拿出培养的细胞瓶(一般我是让它长到90%几再传代的),吸去培养液,可用PBS洗两遍.也可不洗.加入适量0.25%胰酶消化(试瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),让它都浸湿细胞就可以吸去了.等个三十秒就在手上拍打,不要太用劲.就可以看到细胞脱落了,再加入3毫升左右的培养液吹打(这时加的培养液不要太多,否则难吹打成单个细胞!),制成细胞悬液,再传至消毒的培养瓶中(我一般是1传三,三天后又可以传代了)再加入适量培养液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培养箱中培养.在操作过程中要有酒精灯的,瓶口,镊子等可在火上过一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.无菌观念要强!胃癌细胞MKN28和AGS：80%-90%confluency,吸弃原培养液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125％胰酶（10cm）-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->37度消化5-10min-->以完全培液（RPMI1640+10% FBS-->吸打,1：5接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱培养（5%CO2 ,37度，24h一个周期L929细胞：是一种贴壁细胞，贴壁后繁殖迅速，约3－4天传代。