9.高效液相色谱

4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用色谱纯试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。 （4）黏度小些为好 否则造成传质速率缓慢，柱效下降。 （5）应与检测器相匹配。当使用紫外检测器时，流动 相不应有紫外吸收。

第七节 HPLC的应用
•生物化学和生物工程
•医药
•食品分析
•环境分析
•精细化工
HPLC在各领域的主要应用
应用领 域 环境 农业 石油 化工 材料 食品 生物 医药 分析对象举例
常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属 及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。
土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。 烃类族组成、石油中微量成分。 无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆 品、染料。 液晶材料、合成高分子材料。 无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味 剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃。 氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子 化合物。 人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成 分。
5.应用
非挥发性和热不稳定组分的分析，在工业、科学研 究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。 如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、 多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分
析。
一.固定相
第二节 HPLC的固定相和流动相
1.化学键合固定Βιβλιοθήκη : 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖
类、脂肪烷烃）是比较适合的。

在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使 用。
E.蒸发散射光检测器（ ELSD）
ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾 化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光 检测器（光电转换器）等部件构成 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气） 雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相 中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，
2. 液相制备色谱的方法
收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超 载，分离切分使待分离组分成为主成 分（富集）后，再次分离制备。
3. 制备型液相色谱
制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、
进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。

梯度洗脱操作 在液相色谱中流速（压力）梯度和 温度梯度效果不大，而且还会带来一些 不利影响，因此，液相色谱中通常所说 的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离 过程中改变流动相的组成或浓度。
例如，甲醇-水40:60到45:55到50:50 优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善
梯度洗脱（淋洗）
低压梯度
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
液固吸附色谱
2. 稠环芳烃的分析
固定相：十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 º C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系
统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。
色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
2.主要部件
(1) 高压输液泵
A、主要部件之一，压力：15～35MPa。
B、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定、可调、耐腐蚀等 特性
(2) 脱气装置 流动相为什么要脱气
较快 广
少 尚可 可 可 高
快 较窄
少 可 可 可 高
快 广
少 可 可 可 高
3.高效液相色谱法分类
液固色谱 Liquid-Solid Chromatography
液液分配色谱 Liquid-Liquid Chromatography
iorg
Ki iaq
Mobile phase
Stationary phase 固定液易流失 化学键合固定相
三、 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，
流动相的极性小于固定液的极性（正相 ）;
流动相的极性大于固定液的极性（反相 ）。
液液分配色谱
正相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 反相色谱法 1.非极性固定相 C18（简称ODS） 、C8
激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散 射光并通过光电倍增管转变成电信号。
因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关， 而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以 ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样 品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线 漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度 洗脱。 流动相必须是挥发的，不能含缓冲盐类等。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依 据。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙 酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷> 苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。

气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。


气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现 流速不稳定，致使基线起伏。
气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发 生变化。 氧气使荧光消光。
高压梯度 浓度
时间
(5) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm（常用4.6mm或
3.9mm），柱长5～40 cm（常用15cm或25cm）。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 与GC色谱柱不同。
(6) 检测器
a. 紫外检测器
对大部分有机化合物有响应。 特点：
灵敏度高；
制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。
五.液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念和基本理论基本一致。 液相色谱所用的仪器设备和操作条件与气相色谱不 同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以 下几方面：
2.高效液相色谱法与其他分离方法的比较
项目 分离效率 分馏 结晶 低 低 提取 经典柱色谱 TLC 低 低 高 GC 高 HPLC 高
分离速度 应用范围
样品用量 可否用于制备 可否用于痕量分析 分析鉴定 分析灵敏度
慢 窄
多 可 否 可 低
慢 窄
多 可 否 可 低
慢 广
多 可 否 否 -
慢 广
多 可 否 否 -
D.示差折光检测器 (RID)

又称折射率检测器。原理：基于样品组分的折 射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱 出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变 化与样品组分的浓度成正比。

绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RID是
一种通用型的检测方法。

虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。
应用： 对于异构体分离和族分离是最有效的方法， 如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的 分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
各组分的出峰顺序(正相色谱） 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸， 先流出。
极性较大组分滞留作用大，后流出。
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况
一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多 个溶液进行脱气。

(3) 梯度洗脱（类似GC中的程序升温）
优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善

为什么要进行梯度洗脱？
在进行多成分的复杂样品的分离时，经常 会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的 一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。 为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时 间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯 度洗脱技术。
c. 硅碳键型： d. 硅氮键型：
≡Si—C ≡Si—N
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传 质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相 冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。
固定相类型
极性固定相：正相色谱
线形范围大； 流通池可做得很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；
对流动相的流速和温度变化不敏感；
波长可选，易于操作。
b. 荧光检测器（Fluorescence detector）