实验二 家蚕基因组DNA的PCR扩增及电泳检测
2023-2024学年北京市东城区第一六六中学高三上学期期中生物试题
2023-2024学年北京市东城区第一六六中学高三上学期期中生物试题1.脂肪、葡萄糖和ATP的共性是（）A．均含有C、H、O、N、P B．均在线粒体中被利用C．均可以在细胞中大量储存D．均为细胞的能源物质2.光合作用强度受环境因素的影响。
车前草的光合速率与叶片温度、CO2浓度的关系如下图。
据图分析不能得出（）A．低于最适温度时，光合速率随温度升高而升高B．在一定的范围内，CO 2浓度升高可使光合作用最适温度升高C．CO 2浓度为200μL·L -1时，温度对光合速率影响小D．10℃条件下，光合速率随CO 2浓度的升高会持续提高3.下图为某遗传病的家系图，已知致病基因位于X染色体。
对该家系分析正确的是（）A．此病为隐性遗传病B．III-1和III-4可能携带该致病基因C．II-3再生儿子必为患者D．II-7不会向后代传递该致病基因4.赫尔希和蔡斯的T2噬菌体侵染大肠杆菌实验证实了DNA是遗传物质，下列关于该实验的叙述正确的是（）A．实验需分别用含32 P和35 S的培养基培养噬菌体B．搅拌目的是使大肠杆菌破裂，释放出子代噬菌体C．35 S标记噬菌体的组别，搅拌不充分可致沉淀物的放射性增强D．32 P标记噬菌体的组别，放射性同位素主要分布在上清液中5.蚕豆根尖细胞在含3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基中培养充足时间后，置于不含放射性标记的培养基中继续分裂，则第一次和第二次有丝分裂中期染色体的放射性标记分布情况是A．第一次：每条染色体仅有1条染色单体被标记B．第一次：半数的染色体含有被标记的染色单体C．第二次：每条染色体仅有1条染色单体被标记D．第二次：半数的染色体含有被标记的染色单体6.真核细胞核仁染色质的铺展图呈现大树的形状（见下图），此结构是核仁内rRNA基因的DNA片段上进行转录的状况。
对铺展图分析错误．．的是（）A．b段是此时该细胞未被转录的区段B．f是rRNA基因转录产物的5'末端C．RNA聚合酶的移动方向是由右向左D．新合成的RNA上附着大量核糖体7.科研人员测定某噬菌体单链DNA的序列，得到其编码蛋白质的一些信息，如下图所示。
实验123PCR产物的PAGE电泳鉴定
实验一、植物体细胞DNA提取实验二、植物基因组DNA的PCR扩增实验三、PCR产物的PAGE电泳鉴定一、实验目的与要求：（1）了解植物体细胞DNA提取、PCR扩增和PAGE电泳的基本原理和步骤（2）掌握分子生物学基本仪器的操作方法二、实验材料与主要用具：实验材料：玉米新鲜嫩叶0.5g，DNA提取缓冲液，氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，异丙醇，TE，TaqDNA聚合酶，dNTP，硝酸银，甲醛，NaOH等。
主要实验用具：移液器、离心管、低温冷冻离心机、基因扩增仪、电泳仪等。
三、实验方法和步骤1. DNA提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法（Paterson et al,1993）,并稍加修改，具体步骤如下：（1）将0.5g冻叶（或鲜叶）放入放入1.5ml管子中。
加入600μl提取液（表1）电钻研磨，10000 rpm 离心15min（4℃），弃上清；（2）于沉淀中加入600μl 65℃预热的裂解缓冲液（表2），并用牙签搅松，涡旋混匀，65℃水浴60min；（3）加入600μl氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm 离心20min（15℃），将上清转入1.5ml的离心管中。
（4）加50μl 3M的NaAC(pH 5.2) 。
（5）加600μl的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，10000rpm，离心10min（RT），弃上清，于沉淀中加入1 ml 70%的乙醇洗涤，10000rpm离心5min。
倒掉上清液，自然通风干燥DNA小团；（6）加400 l TE缓冲液（10mM Tris/HCl（PH 8.0），1mM EDTA（PH 8.0），PH 8.0）溶解DNA（4℃，30min以上），并保存。
表4-1 DNA提取缓冲液配制工作液存储液0.35M Glucose 34.68g 6.936g Glucose0.1M Tris.HCl 50 mL 10.0 mL 1.0M Tris.HCl（pH 8.0）5mM Na.EDTA 5 mL 1.0 mL 0.5M EDTA（pH 8.0）2% PVP 100 mL 20.0 mL 10% PVP 1%（V/V）β-Me 5 mL 1.0 mL Liquiddd Water 340 mL 68.0 mLTotal 500mL 100 mL表4-2 裂解缓冲液配制工作液存储液1.4M NaCl 40.908g 8.1816g Salt0.1M Tris.HCl 50 mL 10 mL 1.0M Tris.HCl（pH 8.0）20mM Na.EDTA 20 mL 4 mL 0.5M Na.EDTA（pH 8.0）2%CTAB 100 mL 20 mL 10% CTAB2% PVP 100 mL 20 mL 10% PVP 1%（V/V）β-Me 5 mL 1.0 mL Liquiddd Water 225 mL 45 mLTotal 500 mL 100 mL2.引物来源与标记分析2.1引物来源试验所用200对引物由上海生物工程公司合成，引物根据玉米基因组设计。
实验4转基因植物PCR基因扩增及电泳检测
实验4转基因植物PCR检测四、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测一、实验目的1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。
2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、原理PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。
由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一，而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。
故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。
三、试验材料提取的甘薯基因组DNA。
四、试剂4.1 PCR反应引物序列35S：5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3，//5，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，；NOS：5，-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3，//5，-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3，。
4.2 PCR反应试剂：无菌去离子水；模板DNA；20 μmol / LPCR 引物；5U/μL Taq DNA 聚合酶；2.5 mmol / L dNTPs；10×PCR 缓冲液；25 mmol / L MgCl2，25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白4.2 核酸电泳相关试剂（见实验6）五、仪器5.1 PCR扩增仪。
5.2 微量移液器。
5.3 吸头。
5.4 电泳仪。
5.5 电泳槽。
5.6 凝胶成像仪。
5.7 PCR管。
六、实验步骤6.1 转基因植物PCR基因扩增6.1.1.1 按待检样品数（每一个样品分设35S和NOS两个检测反应）并加空白对照、阴性对照、阳性对照，取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管，按下表用记号笔在管壁上编号：6.1.1.2 之后按上述顺序依次加入各PCR反应液。
实验二：目的基因的PCR扩增(含结果)
实验二热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延伸。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA 酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP 与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
目的基因的检测与鉴定步骤
目的基因的检测与鉴定步骤目的基因的检测与鉴定是一项重要的生物技术，它可以帮助科学家们了解生物体内的特定基因，以及这些基因在生物体中的功能和表达方式。
下面将介绍目的基因的检测与鉴定的步骤。
第一步：提取DNA样本目的基因的检测与鉴定首先需要从生物体中提取DNA样本。
这可以通过不同的方法来实现，比如采用化学试剂的方法或者利用机械方法破碎细胞膜来释放DNA。
第二步：PCR扩增在获得DNA样本后，科学家们需要进行PCR扩增，以增加目的基因的数量。
PCR是一种基于DNA聚合酶的体外DNA复制技术。
它可以在短时间内扩增目的基因的特定区域，从而使其数量增加。
第三步：凝胶电泳分离PCR扩增后，科学家们需要进行凝胶电泳分离，以检测目的基因的扩增效果。
凝胶电泳是一种分离DNA片段的常用方法，它可以根据DNA片段的大小将其分离出来，并通过染料来可视化目的基因的扩增结果。
第四步：测序分析凝胶电泳分离后，科学家们需要进行测序分析，以确定目的基因的具体序列。
测序分析可以通过不同的方法来实现，如Sanger测序或者新一代测序技术。
通过测序分析，科学家们可以获得目的基因的完整序列信息。
第五步：功能鉴定在得到目的基因的序列后，科学家们可以进行功能鉴定，以了解目的基因在生物体中的功能和表达方式。
功能鉴定可以通过不同的方法来实现，如基因敲除、基因过表达或基因沉默等技术。
通过功能鉴定，科学家们可以深入研究目的基因的生物学功能。
目的基因的检测与鉴定包括提取DNA样本、PCR扩增、凝胶电泳分离、测序分析和功能鉴定等步骤。
这些步骤的顺序和操作方法可以根据具体的实验目的和要求进行调整和优化。
通过目的基因的检测与鉴定，科学家们可以更好地了解生物体内的基因信息，为生命科学研究和应用提供基础支持。
动物寄生虫病PCR诊断技术
动物寄生虫病PCR诊断技术聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。
通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。
而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。
随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。
一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。
二、实验仪器和材料（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。
单个虫体。
2.器具。
超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。
3.试剂。
(1) 乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。
(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 µl 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 µl、50 mM EDTA（pH 8.0）150 µl、10%SDS 30 µl。
DNA提取+PCR+电泳实验报告
题目：水稻DNA提取，扩增与电泳实验组别：第三组一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤二、实验原理：1、提取DNA一般用水稻幼叶，先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎，然后加TPS抽提液水浴提取DNA，最后用无水乙醇沉淀DNA即可。
（DNA提取原理）2、DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
（PCR原理）3、琼脂糖凝胶电泳：借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP 溶液、引物、TPS抽提液、无水乙醇、电泳槽、GoldView、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker四、实验步骤1、DNA提取（1）取水稻叶子少量置于2ML离心管内，加入液氮研磨，带磨成粉状后，加1MLTPS抽提液，然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。
同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻（2）水域结束后，取出离心管放入离心仪中，13600r/min离心12min，然后小心的取出离心管，将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml，加入600ul冷冻的无水乙醇，放入-80℃下冻10min，拿出放入离心仪13600r/min离心5min（3）到处上清液，倒置，晾干约3h（4）加入双灭菌水60ml，放入摇床中振荡一夜。
2、PCR（1）按所需配料表，向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物，后引物，然后加入提取的DNA，混匀（2）将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序3、电泳（1）称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。
混匀倒入锥形瓶中，加热溶解混匀。
待冷却至不烫手时加入GoldView，混匀，倒入已经插好梳子的配胶槽中，冷却30min至1h（2）将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中（将有点样孔的一端靠近负极）然后按照顺序点样，每个样的用来那个为4ul，在中间的空上点Marker溶液3ul（3）打开电泳开关，电泳32min左右（4）电泳结束后，将胶取出，放入透视镜下照射，拍照，读带五注意事项1、提取dna的时候用乙醇是沉淀时，必须将乙醇冰冻2、在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下。
dna片段的扩增及电泳鉴定教案
dna片段的扩增及电泳鉴定教案标题：DNA片段的扩增及电泳鉴定教案引言：DNA片段的扩增及电泳鉴定是现代分子生物学中常用的实验技术，它们具有广泛的应用领域，包括基因组测序、遗传多态性的研究以及疾病诊断等。
本教案将介绍DNA扩增的原理和方法、电泳鉴定的步骤以及实验注意事项，帮助学生理解并掌握这些关键技术。
一、DNA扩增的原理和方法：1. DNA扩增的原理：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是DNA扩增的一种重要方法，其核心原理是在体外模拟DNA的自然复制过程。
2. DNA扩增的方法：a. 准备PCR反应体系：PCR反应需要DNA模板、引物、聚合酶、四个单核苷酸和缓冲液等组分。
b. 反应条件设置：反应温度、时间和循环次数等参数的设置要合理，以确保PCR反应的成功。
c. 扩增步骤：(1) Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至高温，使DNA双链断裂成单链。
(2) Annealing（退火）：降温，引物与DNA低温下结合。
(3) Extension（延伸）：提高温度，聚合酶利用引物为模板合成新的DNA 链。
d. PCR反应结果分析：可以通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测和鉴定。
二、电泳鉴定步骤：1. 准备电泳装置和琼脂糖凝胶：设置电泳槽、注入电泳缓冲液并制备琼脂糖凝胶。
2. 样品制备：将PCR反应产物加入DNA加载缓冲剂，充分混合。
3. 装载样品：将样品缓冲液混合物垂直地装入琼脂糖凝胶槽中的孔内。
4. 电泳：连接电源，设置合适的电压和电流，进行电泳操作。
5. 鉴定和分析：根据DNA片段的大小进行鉴定和分析，可以使用DNA标准品作为参照。
实验注意事项：1. 严格遵守实验室操作规范，佩戴实验手套和眼镜。
2. PCR反应过程中需避免引物和其他试剂的污染。
3. 电泳前需确认电泳装置的正确连接，以及电泳缓冲液的配制和浓度调整。
4. 电泳过程中需注意电流和电压的设置，避免样品过度迁移或溢出。
高中生物学新课程选择性必修3实验教学设计6：DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR的原理及方法
教学难点
琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理及方法
教学方法
讨论法，实验法，讲授法
实验原理
1.PCR技术是细胞外的DNA复制过程，通过设置不同温度条件，利用模板、引物和DNA聚合酶可以获得更多的子代DNA。
2.DNA作为生物大分子，在pH约8.5的琼脂糖凝胶电泳拥有其特异性电泳速度，可以用于DNA分子分离、纯化及鉴定。
2.用文字说明二苯胺鉴定和琼脂糖凝胶电泳的区别。
学生进行比较分析、分享观点并整理笔记。
通过比较，完善认识，增强理解。
环节五课堂小结（略）
作业布置
填写实验报告册。
教学反思
1.立足学校实验条件、材料设备不足的客观实际，借助视频微课可以让学生较好地理解掌握PCR及琼脂糖凝胶电泳检测DNA等原理及过程。
2.在教学过程中，先引导学生回忆必修一和必修二的有关DNA复制的知识，在此基础上，让学生加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。这些策略的有效应用，提高学生学习热情和学习知识的准确性。
环节二基础回归
1.引导复习体内DNA分子的复制：
概念，时期，场所，条件，特点，原则，准确复制的原因。
2.引导讨论DNA的酸碱性及分子量大小。并做评价。
听取任务，复习梳理，确定表述，及时纠错。
回归相关知识原理，创设新知学习基础。
环节三新知学习
借助微课学习，引导学生归纳总结。
1.PCR技术
⑴条件
①引物：本质及作用；
2.DNA新链由5′端向3′端延伸。
3.琼脂糖凝胶电泳的原理：DNA作为生物大分子，在pH约8.5的琼脂糖凝胶电泳拥有其特异性电泳速度，可以用于DNA分子分离、纯化及鉴定。
【课件】探究实践DNA片段的扩增及电泳鉴定课件高二下学期生物人教版选择性必修3
未出现扩增条带可能的原因有： 出现非特异性扩增带可能的原因有：
①TaqDNA聚合酶失活；
①引物特异性不强或容易聚合成二聚体
②引物出现质量问题；
②复性时的温度过低
③变性时温度低，变性时间短 ③DNA聚合酶的浓度过高
④Mg2+浓度过低
④模板DNA出现污染
⑤Mg2+浓度过高
凝胶载样缓冲液
溴酚蓝和二甲苯青FF是两种在电场中以预知速率向正极泳动的染 料。溴酚蓝呈现蓝紫色，与长300bp的双链线状DNA的迁移速度 相同，而二甲苯青FF呈现蓝色，与长4kb的双链线状DNA的迁移 速度相同。这两种指示剂能够分别显示300bpDNA和4kbDNA的电 泳进程，指示终止电泳的时间。在电泳时，当溴酚蓝染料移动 到距凝胶前沿1~2cm处，要停止电泳。染料的另一个作用是使样 本呈现颜色，完成加样的加样孔呈现 蓝色，未加样的加样孔为
探究·实践
五、结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电 泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp。
探究·实践
五、结果分析与评价
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产 生这个结果的可能原因。
(D2N)PAC半R扩保留增复DN制A片段还利用了 3’-
3的0原理。一次 5’-
3’-
PCR一般要经历 次循环。
5’-3’ 高温 -5’ 变性
3’-
1次循环
-3’
5’-
-5’ 延伸
-3’ 中温 5’-
-5’
3’-
-3’
-5’ 复低 性温
-3’ -5’
目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳PCR讲课课件
DNA相对分子质量 标准物
目的基水因的平获型取扩平增与板检电测及泳相槽关技术之获取电泳PCR讲课
• 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 • （2）电压： • 电压高，DNA迁移快。 • 一般采用低电压高浓度凝胶来提高分辨率。 •◎
目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳PCR讲课
• 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 • （3）电泳缓冲液： • pH 8.0左右，离子强度 0.02～0.05 • 硼酸盐缓冲液（TBE）：缓冲能力大于TAE； • 醋酸缓冲液（TAE）：对高分子量DNA， TAE分辨
的电极移动的过程称为电泳。 • 凝胶电泳：用琼脂糖或聚丙烯酰胺等作为支持介质的
（区带）电泳法称为凝胶电泳。
• 琼脂糖凝胶电泳：检测、分离核酸(DNA、RNA)； • 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：检测分离蛋白质与小分子核酸
• 基因工程中重点应用琼脂糖凝胶电泳。 ◎
目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳PCR讲课
一、物理化学方法 • 双链DNA碱基配对原则： • G≡C（3个氢键） • A=T （2个氢键） • DNA中GC含量高，热稳定性高，熔解温度（Tm值）
高。 • 对GC含量高的基因，可适当控制温度使富含A=T
区解链，富G≡C区仍维持双链，在利用S1核酸酶， 切去单链部分，得到富含G≡C区的待分离基因。
目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳PCR讲课
• 1、PCR反应体系组成 • （1）作为模板的DNA，即DNA模板； • （2）寡聚核苷酸引物，要求与被分离（扩增）的
目的基因两条链各一端序列互补配对； • （3）有热稳定性的DNA聚合酶，如TaqDNA聚合
酶； • （4）4种dNTP，N=A、G、C、T； • （5）反应缓冲液，Tris.HCl（pH8.3），含Mg2+。
实验2真核生物基因.组DNA的提取、电泳
8-羟基喹啉： 0.1% 黄色酚相指示剂 抗氧化剂
6、酚/氯仿
氯仿作用： a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；
7、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1)
氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。
• BSA ：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。 • 内切酶：含50%甘油，-20℃保存。 • 反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓 度应<5%。
提取模板DNA的常见目的
1. Southern blot
DNA水平基因结构分析的重要策略之一. 基因组DNA酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。
电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物， 煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作 用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于 受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量 较小的DNA片段跑在前面。
二、 琼脂糖凝胶电泳的实验操作 1. 制备1%琼脂糖凝胶
2. 样品准备及上样 每组两份样品： 样品1：8l基因组DNA + 1 l 10×上样液，混匀。 样品2：10l酶切产物 + 1 l 10×上样液，混匀。
2.0
思考： 凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？
五、 电泳仪的使用方法
稳压: 电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。 如箭头所示。
六、预期结果
用内切酶酶切基因组，电泳结果
可出现连续的、弥漫云雾状带， 称 Smear 带。
识别 6bp序列的内切酶，平 均每4096 bp长度出现一次切割 概率。
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、实验步骤1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
10实验十 PCR基因扩增及PAGE电泳检测
ddH20 10×PCR缓冲液 4×dNTP 2.5mmol/L 引物1 2.5µmol/L 引物2 2.5µmmol/L 模板DNA Taq酶 13.5 μL 2 1 1 1 1 0.5
Total 20 μL 注意:操作中加药品的顺序。
(二)按下述程序进行扩增:
在混合样品中各组分的迁移率主要取决于 分子大小和形状以及所带电荷多少。
三、仪器、材料与试剂
(一)仪器 1．PCR仪 2．垂直板型电泳槽；直流稳压电源； 50μl或100μl微量注射器
(二)材料
1．DNA模板：
2．4种dNTP，
3．引物1、引物2
4．Taq酶（或Pfu酶）
5．PCR buffer 6．PAGE 凝胶 贮液 7. DNA分子量标准物（DL15000）
（如扩增程序编号0000000566）
①94℃预变性5 min； ②94℃变性 30 Sec ③55℃退火 30 Sec ④72℃延伸 1 min ⑤ 72℃ 充分延伸10 min
30个循环
⑥4℃
保温
(三) 安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心 式 垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置 略有不同，但主要结构相同，且操作简单， 不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要 求进行操作。 主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要 洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。 玻板的清洗方法 抽真空、注胶及胶凝聚前注意事项
火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的 DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成 为新一轮循环的模板，经过25-30个循环 后模板DNA可扩增10
6
~ 10 9倍。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE
实验9转基因植物PCR基因扩增及电泳检测
实验9 转基因植物PCR检测三、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测一、实验目的1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。
2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、原理PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。
由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一，而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。
故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。
三、试验材料提取的甘薯基因组DNA。
四、试剂4.1 PCR反应引物序列35S：5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3，//5，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，；NOS：5，-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3，//5，-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3，。
4.2 PCR反应试剂：无菌去离子水；模板DNA；20 μmol / LPCR 引物；5U/μL Taq DNA 聚合酶；2.5 mmol / L dNTPs；10×PCR 缓冲液；25 mmol / L MgCl2，25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白4.2 核酸电泳相关试剂（见实验6）五、仪器5.1 PCR扩增仪。
5.2 微量移液器。
5.3 吸头。
5.4 电泳仪。
5.5 电泳槽。
5.6 凝胶成像仪。
5.7 PCR管。
六、实验步骤6.1 转基因植物PCR基因扩增6.1.1 每管PCR反应溶液如下：6.1.1.1 按待检样品数（每一个样品分设35S和NOS两个检测反应）并加空白对照、阴性对照、阳性对照，取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管，按下表用记号笔在管壁上编号：反应所需其他成分的总量先加在一1.5mL离心管中混匀，后用移液器分装至各管，再分别添加引物和模板。
DNA的提取和电泳实验报告
基因组DNA的提取和电泳（实验五）实验报告一、实验目的了解DNA提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析DNA技术。
二、器材和试剂1. 器材水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等2.试剂1.1mol/L Tris.Cl(pH8.0) 的配制：称取12.11g 的Tris，置于80 mL的ddH20,加入浓盐酸（约4.2 mL）,调节pH值至8.0，定容至100 mL。
2. 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)的配制：18.61g Na2EDTA·2H2O，加入80 mL的ddH2O,用NaOH颗粒调pH值至8.0（约需2 g），定容至100 mL。
3. 提取缓冲液的配制：100 mmol/L Tris.Cl(pH8.0), 20 mmol/LEDTA, 500 mmol/L NaCl,1.5%SDS4. 80/4/16氯仿：异戊醇：乙醇5. 6☓Loading buffer：0.15％溴酚蓝，0.15％二甲苯青FF，5 mmol/L EDTA，50％甘油三、实验步骤1.在15mL的离心管中加入5mL的提取缓冲液，60℃水浴预热。
2.植物叶1-2g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状，60℃水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动。
3.5000 rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，4.加入5 mL 氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相混匀。
5.室温下离心5000 rpm离心5分钟。
6.仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状沉淀。
7.离心5000 rpm，离心5 min，弃去异丙醇，室温晾干。
8.视沉淀多少，加入1mL左右ddH2O溶解，可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。
9.取DNA样品5 µL，加入1 µL6☓Loading buffer，混匀，加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔中，电泳，检测DNA的分子大小。
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实验二家蚕基因组DNA的PCR扩增及电泳检测
一、实验学时: 6学时
二、实验类型:设计性实验
三、实验目的
1 、学习PCR反应的基本原理与实验技术；
2 、了解引物设计的一般要求。
四、实验原理
单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA多聚酶按5’-3’方向复制出互补DNA。
这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（P），合成的互补DNA称为产物DNA。
双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。
PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA 5‘端的引物（P1）对应于上链DNA单链的序列，3’端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列，P1和P2按5’-3’方向相向配置。
在含有引物、DNA合成底物dNTPs （dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。
引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。
理论上如果引物及dNTP的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板
DNA无限扩增。
PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃，复性温度为37℃～55℃，合成延伸温度为72℃ DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为106～109。
四、操作步骤
1、在25 μl的反应体系中加：
模板DNA 1.5µl
10×reaction buffer 2.5µl
2.5mM MgCl2 2.5µl
2.5mM dNTP 1µl
上游引物1µl
下游引物1µl
Taq DNA聚合酶0.5µl
加ddH2O体积15µl
2、在PCR仪上进行扩增，扩增程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40 s,共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
3、扩增产物5-10 μl与2μl 6×上样缓冲液混匀，点样到1%琼脂糖凝胶中电
泳检测结果。