曲霉菌株的保藏与复壮
Xi-3米曲霉菌株的保藏与复壮
初筛与复筛等过程，可 以选育 出理想的菌株。
２１单孢 子 悬浮 液制备 ．
将 出发 菌株接 种于 斜面豆 汁培养 基 上 ，３ ℃培 养 ０ ３ ｄ ｄ 。成 熟后 ，用 含 ０５ ．％吐温 ８ ０的无 菌 水 １ｍ ， ０ Ｌ
阐 邕
２ 年 ３ ・４５・ ０ １４期 ０第 ５ ｇｇ ４ 期
，
摇平 。每个皿 内含 ４ ５ － 单孢子为宜 。置于 ３ ￣培养 ０ Ｃ
２ ｈ ７ｈ ４ ￣ ２ ，注 意观 察 。透 明 圈形 成大 小 ，分别 用游 标
２Ｘｉ 曲霉 复壮 的研 究 － ３米
菌 种 退化 是 生 物 学 特 征 之 一 。菌 种 具 有 典 型 的 优 良性 状 ，有 明显 的下 降现 象 称 为菌 种 退 化 ，也 叫 做 衰退 。这 是一 个 从量 变 到质变 的逐 步演 化 的过程 。 如 不及 时发 现 和采 取 有 效 措 施 ，会 使 群 体 表 现 出严 重 的衰 退 。通过 复 壮 ，作 单孢子 悬浮 液 ， 中间培养 、
ＬＵ ｎ — ｉ， Ｍｉ ｇ ｘ ａ ＸＵ ｉｙ ｎ ＣＡＯ ｎ Ｈａ— ａ ， Ｂｉ
（ｈｎ ｏｇ ｏ －ｌ ｉ ｏｉ ｌ ｎｉｅｒ ｇＣ ． ｔ， ａ＇ ２ １０， ｈ ａ Ｓ ａｄｎ Ｂ ｌ ｌｙＢｏ ｇｃ Ｅ ｇ ｅｎ ｏ Ｌｄ Ｔｉ ７００ Ｃ ｉ ） ｙｅ ｌ ａ ｎ ｉ ， ． ￣ ｎ Ａ ｓ ａｔＴ ｉｐｐ ｒ ｔ ｄｃｄ ｈ ｊｖｎｔ ｎ ｎ ｅｅ ａｏ ｆ ｓｅ ｉｕ ｙａ ｐｏｕｉｇ ｅｔ ｌ ｒｔ ｓ ｔｉ． ｒ ｅｖｔ ｎ ｉ ｂｌ ｏ ｈｓ ａｅｉ ｒ ｕｅ ｅ ｅ ｅａｏ ｄ ｒ ｒ ｔ ｎ Ａ ｐｒ ｌ ｓ ｒｚｅ ｒ ｃ ｕ ａｐｏ ａ ｉｄ ａ ｓＰｅ ｒａｏ ｔ ｒ ： ｏ ｎ ｔ ｒｕ ｉ ａ ｐ ｓｖｉ ｏ ｇｌ ｏ ｄ ｎ ｎ ｒ ｅ ｅ ｅ ｌ ｎ ｓ ｉ ｗｈ
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
单元3 菌种保藏与复壮
单元3 菌种保藏与复壮模块1 菌种的保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。
所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。
一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。
(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
一、微生物菌种保藏要求在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本方法：由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
世界上最早建立的菌种保藏室捷克微生物学家Frantisek Kral布拉格大学副教授，讲授细菌学和真菌学课程。
1890年，Kral建立了私人细菌学实验室，即KRAL细菌学实验室，同年建立了世界上第一个微生物菌种保藏室，保藏有800多个微生物菌种，相继公布了5个版本的菌种目录。
1911年，去世，二战被毁，原保藏的菌种几经转移，至今已寥寥无几。
菌种保藏、衰退及复壮（3）
菌种保藏、衰退及复壮（3）菌种保藏、衰退及复壮（3）来源：青岛海博三、菌种的复壮（一）复壮狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。
（二）菌种复壮的主要方法1、纯种分离法通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。
常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。
例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。
另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。
它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。
后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。
对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。
例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。
如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。
根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。
菌种的复壮与保藏(陈)
陈灵芝
微生物教研室 2011
• 向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗 下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬 液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线 菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 • 真空抽去沙土管中水分。 • 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥 处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。 或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥 器内保存。 • 保藏时间2～10年。
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培养： 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养 至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～ 37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植 一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉 等，须1～3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外 和污染造成损失。
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复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶 部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
陈灵芝 微生物教研室 2011
陈灵芝
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6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效 防止菌种衰退的方法。
陈灵芝
微生物教研室 2011
二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
曲霉菌株的保藏与复壮
曲霉菌株的保藏与复壮柏芳青(滨州职业学院,山东滨州 256603)摘要:对在发酵制曲生产中曲霉试管菌株的作用及效能作了客观分析,并对妥善保藏试管菌株,及对退化菌种进行分离复壮等保持试管菌株优良性能的方法作了详细叙述和介绍。
关键词:曲霉;菌株;保藏;复壮中图分类号:T S201 57 文献标识码:B 文章编号:1000 9973(2007)09 0023 03The preservation an d recovery of mildewBAI Fang qing(Binzhou Vo catio nal Co lleg e,Binzhou 256603,China)Abstract:This ar ticle gives an objectiv e analysis on the function and efficacy of the test tube mildew .Which ar e produced in the pro cess of zym osis.It also elaborates the m otho els of ho w to keep the eminent functio n o f the test tube fungus,such as,the metho d of copping w ith preserving the test tube mildew and separating and r em oving the deg enerative mildew.Key word:m ildew ;g erm;preserv ation;recovery 曲霉菌广泛存在于自然界的谷物、空气、土壤及各种有机物质上,是重要的生产菌类,工业上采取曲霉生产酒类、酱油、食醋、酱类、酶制剂及有机酸等。
比如,在发酵工业生产中,米曲霉用于酱油及酱类制曲及发酵生产,黑曲霉及甘薯曲霉在制酒和食醋生产中用于麸曲生产,同时大量用于酶制剂生产,是具有强大生命力的菌株。
菌种的复壮与保藏
基本程序
• 1安瓿管的处理
• 2 保护剂
直径8~10mm，长度不小于 100mm，洗净高压备用。 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、 蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。 最适培养条件、生长后期。产孢子的 微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌 24~48h，酵母72h，放线菌和丝状真菌7~10d。
半固体穿刺保藏法 • 穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏 • 适用：好气性细菌，酵母等 • 保藏期：6~12个月
用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状 培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待 微生物生长良好后覆盖2~3mm无菌液体石蜡.石蜡 可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用 于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌 等。
常用的有蒸馏水、0.25MPBS或生理盐水，关 键是试管应密封好，以防水分蒸发。
低温保藏法 •方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要 重新移种后在冷藏。
三、菌种保藏的注意事项
• 菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢 • 菌种保藏所用的基质：碳源 • 操作过程对细胞结构的损害
创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加 相应药物，及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒 的丢失
采用有效的菌种保藏方法
从菌种管理的措施上考虑
菌种复壮
二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
•低温保藏法
斜面保藏法 • 接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 • 适用：各大类 • 保藏期：3~6个月 • 缺点：保存期短，传代多，易退化
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心
保藏曲霉菌种的一种简易方法
保藏曲霉菌种的一种简易方法
林茂丛
（福建省周宁县综合食品厂）
我们用麸皮斜面加干燥剂常温保藏曲霉菌种，得到较好的效果，现将方法介绍如下。
一、方法
取新鲜的含淀粉较少的麸皮加55—75%水拌匀，分装在小试管中，装量为试管长度的3/4—4/5，然后用玻璃棒将其压成斜面状，压后的麸皮试管长度的2/5—1/2（简称麸皮斜面）。
1公斤蒸汽灭菌30分钟后，将在琼脂斜面上长好的曲霉菌种接种麸皮斜面，在适当温度下培养至孢子成熟。
选出孢子生长旺盛、顶蘘丰满、外观颜色正常、无杂菌的麸皮斜面菌种，加贴标签保藏。
取内径大于上述麸皮斜面试管外径，长度大约4厘米的大试管，洗净烘干后装入无水氯化钙，装量为1.5—2.0厘米厚。
在105℃烘箱内烘3小时冷却后，用棉花将氯化钙盖住，将待保藏的麸皮斜面菌种棉塞朝下放入，使顶部正对氯化钙，再在大试管上加棉塞并严密封蜡，置室温或低温中保藏。
二、效果
用上述方法保藏的黑曲霉AS3.758，四年多以后检查，孢子生长情况无显著变化，酶活力也能保持原有水平；东酒一号保藏一年后，生孢子能力显著减弱，但酶活力不降低；米曲霉AS3.951B保藏一年后，生孢子情况无改变，酶活力略有降低。
三、注意事项
1、麸皮含水量应掌握适当，一般以能使孢子生长良好为前提尽量少加水。
为此，
对不同菌种应通过试验加入不同水分。
如保藏黑曲霉AS3.758，麸皮含水量为55—60%；保藏东酒一号和米曲霉AS3.951，麸皮含水量为70—75%。
2、如培养好的麸皮斜面菌种试管壁上有水珠，应先用氯化钙干燥数日后再保藏。
科学出版社《微生物学通报》一九八一年第八卷第一期 P41。
菌种的衰退、复壮和保藏
纯种的分离方法
平板划线分离法 菌落纯 平板涂布分离法
平板倾注分离法
细胞纯
用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
.
三、菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
.
2. 衰退的原因
1）根本原因在于基因自发突变； 2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占
了优势； 3）与培养条件有关。
衰退是发生在微生物细胞群体中的一 个由量变到质变的逐步演变的过程。
.
二、衰退的防止与复壮
（一）防止衰退的措施 p228
1. 减少传代次数； 2. 创造良好的培养条件； 3. 利用不易衰退的细胞传代 4. 采用有效的菌种保藏方法；
五、菌种的衰退、复壮与保藏 1. 菌种衰退的表现、原因与防止措施。 2. 菌种保藏的原理与常用的保藏方法。ATCC 和 CCCCM采用的菌种保藏法。
.
第九章 微生物的生态
生态学：
研究生物及其环境条件间相互作用规律的科学 。 根据生态学的研究对象和采用的研究方法不同, 生态学的 分类不同。
微生物生态学：
6. 筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法， 淘汰野生型的方法
7. 抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。
8. 名词： 营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基， 完全培养基，补充培养基，点突变，转换， 颠换，移码突变，染色体畸变，光复活作用
.
三、基因重组与杂交育种 1. 了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。 名词概念： 转化，转染，转导，普遍转导，局限转导， 低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导， Hfr菌株， 溶源转变。
第七章菌种的保藏与复壮-第二章-菌种的保藏与复壮
(六)真空冷冻干燥法
• (6)保藏及冻干管的启用
密封好的冻 干管在 4℃或 -18℃下保藏。当需用冻干 菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒， 用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿 顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷 的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻 轻敲碎管口，加入 0.3 ～ 0.5ml 液体培养 基溶解冻干菌块成为悬液，用无菌滴管 或接种环移至斜面或液体培养基进行培 养。
(六)真空冷冻干燥法
• 1.冷冻干燥的基本原理
即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减 压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达 到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空 气隔绝，达到长期保藏的目的。 • 2.设备 冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部 分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻 系统。干燥箱可控制温度范围为-40～40℃
(六)真空冷冻干燥法
• 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、
除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不 宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细 菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类 微生物都适用，不宜用冻干法保存的微 生物不到 2% 。冷冻干燥保存的菌种存活 时间长、效果好，一般菌种可保存5年以 上，有的可保藏 15 年以上不发生变异。 还具有体积小、不易污染、便于运输等 优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏 方法。
(四)干燥保藏
• 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于
干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达 到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢 或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生 产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方 便，控制接种量以及对菌种的保护作用， 通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝 体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进 行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、 滤纸、硅胶及大(小)米等。
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曲霉菌株的保藏与复壮柏芳青(滨州职业学院,山东滨州 256603)摘要:对在发酵制曲生产中曲霉试管菌株的作用及效能作了客观分析,并对妥善保藏试管菌株,及对退化菌种进行分离复壮等保持试管菌株优良性能的方法作了详细叙述和介绍。
关键词:曲霉;菌株;保藏;复壮中图分类号:T S201 57 文献标识码:B 文章编号:1000 9973(2007)09 0023 03The preservation an d recovery of mildewBAI Fang qing(Binzhou Vo catio nal Co lleg e,Binzhou 256603,China)Abstract:This ar ticle gives an objectiv e analysis on the function and efficacy of the test tube mildew .Which ar e produced in the pro cess of zym osis.It also elaborates the m otho els of ho w to keep the eminent functio n o f the test tube fungus,such as,the metho d of copping w ith preserving the test tube mildew and separating and r em oving the deg enerative mildew.Key word:m ildew ;g erm;preserv ation;recovery 曲霉菌广泛存在于自然界的谷物、空气、土壤及各种有机物质上,是重要的生产菌类,工业上采取曲霉生产酒类、酱油、食醋、酱类、酶制剂及有机酸等。
比如,在发酵工业生产中,米曲霉用于酱油及酱类制曲及发酵生产,黑曲霉及甘薯曲霉在制酒和食醋生产中用于麸曲生产,同时大量用于酶制剂生产,是具有强大生命力的菌株。
但也存在一些其他曲霉菌类,比如黄曲霉、毛霉、根霉等,他们在制曲生产中作为杂菌,消耗原料养分,降低生产效率,分泌有害物质,影响纯种发酵,成为有害菌。
同时,曲霉菌和其他微生物一样,具有基因变异性,随着时间、环境、条件变化,菌株性能退化,生长势下降,生长繁殖能力降低,有的感染杂菌,给生产造成严重危害。
所以,在生产中选育、使用优良的菌种至关重要,它关系到提高发酵产品的产量和质量。
实践经验告诉我们,要保证菌种生产的高质量和稳定性,首先要保证有一个高质量的试管菌株。
俗话说:没有好种长不出好苗。
使用优质的种子,才能保证下面的生产有一个顺利的过程,否则,你本身提供的就是一个劣质种子,经过几代繁殖扩育,只能是把低劣的质量越扩越大,最后得到一批低质量的菌种。
所以在生产中,保证试管菌种的优质高效至关重要。
下面,笔者就怎样保持所使用曲霉试管菌株的优质高效谈一点自己的看法。
1 试管原菌的取得曲霉试管原菌的取得一般是在土壤、水、空气、植物的根、茎、叶、花、果以及动植物的残骸中,通过筛选、增殖培养、分离培育取得。
经选育的菌种,酶系纯正,性能稳定,具有酶活力高、生产周期短、培养基简单、管理方便,制出产品产率高、风味好等优点。
目前,试管菌种的选育工作大多由国家或地方科研机构进行,因设备及人才原因,大多数厂家尚无能力去进行开发。
所用试管原菌由科研机构或其他厂家提供。
厂家所作的工作就是在移接和保管试管菌时,保持原菌性能,向大生产提供优良菌株。
2 试管菌种的移接与保管收稿日期:2007-04-08第9期2007年9月中国调味品CHINA C ONDIMENTN o.9Sep.20072.1 试管菌株培养基培养基的成分和配比,对微生物的生长发育、物质代谢、发酵产物的积累及生产工艺的确定,均有很大影响。
良好的培养基可充分发挥菌株的生理特性,达到良好的生产效果。
相反,若培养基成分、配比或营养物不当,则菌株效能再好,也不能发挥出来。
因此,在发酵工业生产中,除了选用优良菌株外,必须重视培养基的制备。
经过长期生产实践和不断改进,目前使用下列培养基作为曲霉菌使用培养基。
2.1.1 培养沪酿3.042米曲霉豆汁1000mL;硫酸镁0.5g;可溶性淀粉20g;磷酸二氢钾1g;硫酸铵0.5g;琼脂20g;pH 值6.0左右。
豆汁制备:豆粕(或豆饼)加水5倍煮沸(小火)1h,边煮边搅拌,然后过滤。
每100g豆粕(或豆饼)可制成5 B 豆汁100mL。
2.1.2 培养3.324甘薯曲霉6 B 饴糖液,100mL;琼脂2%,2~3g; pH6.0左右,6.0。
2.1.3 适用于大多数曲霉菌生长的培养基察氏培养基:NaNO33g;KCl0.5g;FeSO40.01g;K2H PO41g; MgSO47H2O0.5g;蔗糖20g;琼脂20g;蒸馏水1000mL;pH6.7。
米曲汁培养基:5~6 B 米曲汁100mL;琼脂2g;pH值6.0。
2.2 培养基的配制配料!溶解!校正pH值!加琼脂溶化!过滤分装!塞棉塞、包扎、标注!灭菌。
按照培养基配方,称取各种材料和药品,依次加入水中溶解,调整pH值,将琼脂加入溶液中,加热熔解。
趁热分装试管,装量在大约1/4~1/5处,塞好棉塞,棉塞外用防潮纸或牛皮纸捆扎,并标注。
置于灭菌锅中,1kg/cm2压力灭菌30min,取出置于无菌室中斜躺摆放,待培养基冷却凝固后成试管培养基斜面。
将试管培养基置于30~ 32∀培养箱中培养3~4d,观察无杂菌生长,取出放入冰箱中保存待用。
但存放时间不宜过长,一般不超过一个月。
2.3 试管菌种移接试管菌移接的关键是要确保无菌室及接种室的无菌状态,严格使用工具的消毒灭菌,按照移接规程,将试管口接近酒精灯火焰,移接要迅速,严防杂菌感染。
接种前要贴上标签,标签贴在距试管口约3cm 处,注意不要盖住棉塞,也不能阻挡观察斜面菌长势视线。
注明接种的菌名、日期、接种人姓名。
这一点很重要,它是菌株有效管理的重要一环。
某公司曾出现过只在试管菌株上标注简单的某月某日情况,结果不知是哪一年的某月某日,误拿已严重退化的菌株用于大生产,造成混乱,影响生产。
接种后置于30∀左右恒温箱中培养3d,待菌株全部发育繁殖,孢子成熟后,取出放入冰箱保存。
2.4 试管菌种的保藏微生物具有退化变异性,霉菌也不例外。
在一定条件下,微生物群体经多次传代,退化细胞就会在数量上逐渐占优势,菌株就会表现出退化性。
所以要创造条件妥善保藏,避免菌种的污染、死亡和性状逐渐变化,以保证性能不变或将变化限制在最低范围。
在生产实践中,根据微生物生理、生化特点,人工创造低温、干燥、缺氧条件,使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态,达到保存纯种的目的。
一般有斜面低温保藏法、矿物油保藏法、砂土管保藏法和真空干燥保藏法。
保藏菌种用的培养基应与生产急需的试管菌分开,保藏用培养基,养分不宜太丰富,而生产用培养基则要使菌株适合生产性能,发挥最佳效能。
试管菌株的使用和保管要有明确的概念,在原菌试管移接初期即分类保管,即时用的,下一批用的,短期保存的,长期保存的。
要有一个周密的计划,来保证使用试管菌株的优良性能。
3 试管菌种的分离、复壮试管菌种的分离复壮是菌种保持高性能的有效方法,利用稀释分离,挑选出优良菌株,纯化、选优,以继续保持其优良性能。
微生物存在着遗传性变异,如不进行有意识的人工选择,则大量的自发突变菌种就会泛滥,最后使菌种退化。
开始时,在群体中只有个别细胞发生负变,这时如不采取措施而一味移种接代,则群体中负变的个体细胞比例逐渐增加,最后占优势,从而使整个群体表现出严重退化。
所以,要及早采取措施,通过纯种分24总第343期 中国调味品离纯化,把退化了的菌种群体中个别的尚保持原有典型性状的单细胞分离出来,经过扩大培养,恢复原菌中的典型性状,保持菌种的性能优良、稳定。
3.1 试管菌种的分离纯化方法通过纯种分离,把退化了的菌种群体中个别尚保持原有典型形状的单细胞分离出来,经过扩大培养,恢复原菌种的典型形状。
常用的分离方法很多,概括起来分为两大类。
一类是较精细的单细胞或单孢子分离法,如使用显微操纵器进行单胞分离,可以达到#细胞纯∃即菌株纯的水平;另一类是在琼脂平板上进行划线分离、表面涂布或与琼脂培养基混匀倾注平板以获得单菌落的办法,达到#菌落纯∃的水平。
其中以稀释法简便易行,现介绍如下:3.1.1分离纯化步骤3.1.2 纯化分离用培养基KH 2PO 40.36g;Na 2HPO 41.07g;MgSO 40.5g;NaCl 0.1g;ZnCl 20.014g;FeSO 40.0002g;酪素4g;酪朊氨基酸0.05g;蒸馏水1000mL;琼脂15~20g;pH6.5~7.0。
3.1.3 分离方法将经稀释的孢子悬浮液0.5mL,涂布或与培养基混合倾注平板,30∀培养48h,菌落周围呈现清晰透明圈,测量其透明圈直径与菌落直径比值,然后将比值大的菌落挑入斜面,再作三角瓶麸曲培养,测定其蛋白酶活力及其他生理特性,选定在形状上、生理特性上与原菌株相同的菌株用于生产。
3.2 试管菌种分离复壮应注意的问题首先,根据微生物个别细胞负变带动群体退化原理,应在群体尚未完全退化前进行分离纯化,在实际生产中存在肉眼观察到试管菌彻底退化再分离的例子,此时,已很难分离出纯种,分离失败。
所以,根据笔者的经验,应在试管菌移接到3~4代,肉眼观察尚未退化变异时即进行分离纯化,可得到优良菌株,否则,时间太长,分离不出性能优良的菌种,达不到分离纯化的目的。
其次,对不同的菌要选择合适的培养条件,才能发挥其最佳效能,得到优良复壮菌株。
同时,要尽量减少转代次数,以防菌株转化突变退化。
4 试管菌株的鉴别从事菌种生产,就要对试管菌株的生长状态有一个感性直观的认识,能对优良菌株和已退化、变异菌株做出客观鉴定,在使用时进行取舍。
以AS3.324为例,优良的菌株呈黑褐色,孢子梗短而粗壮,孢子稠密,而退化菌株一是孢子稀疏,孢子梗细长,有的分布杂菌;还有的变异菌株虽孢子稠密但颜色乌黑,有的人误以为AS3.324曲霉菌外观颜色越黑越好,以至制曲出现问题时,根本想不到是使用了退化菌株,却在后期制作管理工作上瞎猜疑,造成人力、物力、时间的浪费。
对菌株使用前,不管是外来提供,还是自己保藏,应根据生长情况做出判断,决定使用与否。
一旦使用退化、变异菌株,就会出现麸曲生产中结块结实、裂缝、升高温或结块松散、感染杂菌等问题,致使成曲酶活力低下,达不到生产要求。
对试管菌株进行妥善保管和正确鉴别,对有退化变异趋向的菌株及时进行分离纯化复壮,保证使用优良菌株,才能使制曲生产顺利进行,最后制得优质成曲。
总之,作为生产厂家,要保证生产的正常进行和高质量,就要认真做好试管菌株的保藏和复壮工作,来保证生产上能随时使用优良的试管菌株,然后加强大生产的后期管理,保证产品的产量和质量。