实验7 考马斯亮蓝G-250染色法
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
操作步骤
1．0~100µg／mL标准曲线的制作： 0~100µg／mL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂， 混匀，室温静置5min后，以管1 混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （µg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 µg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号 蛋白质标准液 （ml） ml） 0.9%NaCl溶液 0.9%NaCl溶液 （ml） ml） 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（µg） 蛋白质含量（µg） A595
1 0
2
3
4
5
6
0.1 0.1 0.1 0.0.9 0.9 5 5 5 5 5 5
2．样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加 入合适浓度的待测样品，使其测定值在标 准曲线的范围内，测定方法同上，由样品 液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1； ．仪器：分析天平；吸管0.1ml× 1ml× 5ml× 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml各一 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml各一 个； 2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 ）标准蛋白质溶液：称取10mg 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 ）考马斯亮蓝G 250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 亮蓝G 250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷 亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷 酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存， 100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存， 在常温中可放置1 在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用 ）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。 NaCl溶液稀释至一定浓度。
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
考马斯亮蓝G250染液的配制
考马斯亮蓝G250染液的配制
1R250。
2100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
310mg G-250，溶于5mL的95%乙醇中，此时溶液为蓝色，再加入了10mL的85%的磷酸，溶液为血红色，可是加水定容到100mL时又成为了蓝色，据文献说应该是褐色，原因：配置溶液的容器未洗干净，可能沾有蛋白质类药品。
用乙醇把容器全部认真的洗干净后重配，不过配好之后需要过滤才可以用。
4中文名为考马斯亮蓝G250，简称G250，分子式为C47H48N3O7S2Na，分子量为854.02，分析纯。
考马斯亮蓝G250是常用蛋白染色剂，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
5中文名为考马斯亮蓝R250，简称R250，分子式为C45H44N3O7S2Na，分子量为825.97，考马斯亮蓝R250是常用蛋白染色剂，可用于染色丙烯酰氨凝胶和琼脂糖凝胶中的蛋白质。
6、考马斯亮蓝G250和R250都可以作为染色剂，不同的配方、不同的染色方法适合于不同性质的蛋白质。
7、考马斯亮蓝分为G250、R250和R350等，R为红蓝色，G为蓝绿色。
例如考马斯亮蓝G250即二甲花青亮蓝。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
选择考马斯亮蓝G-250染色法的原因
一、选择考马斯亮蓝G-250染色法的原因蛋白质测定方法主要有以下几种：凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝染色法。
在测定酱油中的蛋白质含量实验中，我们选择采用考马斯亮蓝染色法。
原因主要有以下几点：1.凯氏定氮法（1）凯氏定氮法的原理是在样品中加入浓硫酸在一定条件下消化后，向消化液中加入氢氧化钠使氨气溢出，并用硼酸吸收，最后用盐酸滴定吸收液来计算蛋白质的含量。
（2）由配料表可知，酱油中含氮化合物包括蛋白质、氨基酸、谷氨酸钠、呈味核苷酸二钠、肌苷酸二钠等化合物。
可见含有非蛋白质氮的化合物种类多，含量高，不能忽略。
此方法最主要的问题是对非蛋白质氮无法分辨，像氨基酸、谷氨酸钠、呈味核苷酸二钠、肌苷酸二钠均为干扰因素，导致结果误差比较大。
2.双缩脲法与福林-酚法（1）双缩脲法的实验原理是铜离子与蛋白质肽键作用生成蛋白质-铜络合物，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律，再用分光光度计测吸光度确定蛋白质含量。
福林-酚法在此基础上经过另一呈色反应—酸性条件下蛋白质还原磷钼酸-磷钨酸试剂，产生深蓝色的磷钼蓝和磷钨蓝混合物，再用分光光度计测吸光度确定蛋白质含量。
（2）双缩脲法灵敏度低，样品中含有不溶性成分，肽链中含有脯氨酸、糖类共存，会影响显色效果，导致最后测量值偏低，不适合测定酱油中蛋白质含量。
（3）福林-酚法测定原理与双缩脲法类似，上述对双缩脲法有干扰的物质对福林-酚法的影响更大，且福林-酚法应用于水溶性蛋白质含量的测定，对于水不溶蛋白质无法检测。
3.紫外分光光度法（1）蛋白质的20种氨基酸在远紫外区(<220nm)均有光吸收。
在蛋白质浓度3~8mg/mL OD280nm光密度与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
（2）非蛋白质成分在紫外区也有吸收以及光散射作用的干扰，在食品分析领域中的应用并不广泛，加之酱油中成分复杂，对结果影响大，不适合用于测定酱油中蛋白质含量。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一 、实验目的
学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白 质含量
二、 实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结 合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶 液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质 结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为 595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应 导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后， 在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故 可以用于蛋白质浓度的测定。
四、实验试剂
1、0.9％NaCL溶液。
2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml）， 准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液 溶解并稀释至2000ml。 3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考 马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入 100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml,过滤。
三 、实验器材
（1）旋涡混合器。 （2）试管1.5cm×15cm（×8） （3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2）， 1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。
0.8 0.2 4 80
A595nm
（二）样品的测定
另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及 考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置 3min，于波长595nm处比色，读取吸光 度，由样品液的考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备
管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度（μg/ml） 0 1 4 0
考马斯亮蓝快速染色液
考马斯亮蓝快速染色液
采用以下方法制备：
1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇搅拌至溶解完全；
2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，利用磁力搅拌器以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；
3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸(也可采用85％磷酸，效果相同)搅拌均匀；
4)加入超纯水定容至1L，采用10000rpm高速离心5min(也可使用普通定性滤纸负抽滤的方式，对最终结果无影响)去除沉淀后即可获得考马斯亮杀菌防腐剂蓝快速染色液。
染色脱色方法如下：1.清洗：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出胶板，切割舍弃浓缩胶瓦克，加入超纯水清洗凝胶一次，再次加入超纯水微波炉中高火加热至沸腾后取出凝胶；2.染色：凝胶尽量滤干水分，放入有盖耐热容器加入快速低刺激考马斯亮蓝染色液，染液需要保证完全覆盖凝胶表面，使用微波炉中高火加热煮沸2-3min；3.初步脱色：取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水使用微波炉中高火加热3-5min即完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；4.彻底脱色：取出凝胶后加入150mMNaCl水溶液，溶液量以完全浸没凝胶且脱色过程中脱色液不坏洒出为度，水平摇床室温50rpm脱色1h即可彻底脱净背景色。
可溶性蛋白质含量的测定
可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G—250染色法一．原理考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。
考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二．实验材料、试剂与仪器设备1．实验材料水稻不同萌发时期的种子2.试剂（1）标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）。
称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。
（2）考马斯亮蓝试剂。
称取100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
3.仪器和设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三．实验步骤1.标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定（1）样品提取。
称取鲜样0.25—0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min 离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质的含量。
考马斯亮蓝G250染色法
蒸馏水定容至1L
3 样品液的准备：
牛血清白蛋白标准溶液(0.1mg/ml)
用0.9%NaCl溶液
稀释至一定浓度的样品液
2.3 主要仪器
722分光光度计
漩涡混合器
移液器
移液管
吸耳球
试管
烧杯
擦镜纸
三 实验方法
3.1 标准曲线的绘制
取6支试管按下表操作，摇匀，2-5min后在595nm 下比色，1号管为对照管，作吸光度-蛋白浓度曲 线
▪ 如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使 弹簧处于松弛状态以保护弹簧。
▪ 最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或60 ％的异丙醇， 再用蒸馏水清洗，自然晾干。
▪ 高温消毒之前，要确保移液器能适应高温。
722 型分光光度计的使用及注意事项
1、插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。先在暗箱盖
开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。 然后盖上暗箱 盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，
注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖， 以免光电管老化。
暗箱
2、将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由 “100”至“0”，若不为“0”，可用“消光零”旋 钮调节
3、将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯 外侧水珠，并依次放入比色杯架中。
▪ 实验类型——基础验证型
▪ 实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染 色法测定蛋白质含量的基本方法
一 原理
465nm
棕红色 酸性溶液中
与蛋白质疏水区结合
考马斯亮蓝G-250染料
青蓝色
595nm
在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白 质和色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白 质浓度成正比，故可用于蛋白质的定量测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250染色法
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1.0Ml(样品提取见LoWry法)，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3结果计算
样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000（2-2）
【方法】
1标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／Ml)的绘制 取6支具塞试管，按表2－1数据配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。
表2－1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表
管号123456蛋白质标准液（ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）020406080100在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
【仪器与用具】
721分光光度计；10Ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具Hale Waihona Puke 刻度试管14支。 【试剂】
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／Ml的标准蛋白溶液;
90％乙醇；
85％磷酸(W／V)；
考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏(灵敏度比ＦolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法 - 华南师范大学生命科学学院 …
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
五、注意事项1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到1 000 mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD，并做标准曲线。
595nm表1 低浓度标准曲线制作管号 1 2 3 4 5 61 000μg／mL标准蛋白液（mL）0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100 OD595（2）0~1 000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。
可溶性蛋白质含量的测定(word文档良心出品)
植物体内可溶性蛋白质含量的测定方法：考马斯亮蓝G－250染色法1.原理：考马斯亮蓝G－250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
2.仪器：721分光光度计；10ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管；1ml3支；5ml3支；10ml具塞刻度试管14支。
3.试剂：90乙醇％（无水乙醇20瓶以下8元1瓶，每瓶500ml）；85％磷酸（500ml 磷酸标准溶液0.1mol/ml，16元钱1瓶）；考马斯亮蓝G－250（80元钱1瓶，1瓶10g）；牛血清白蛋白。
考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶50ml90％乙醇，85％的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
4.标准曲线的绘制4.1、0～100μg/ml标准曲线的制作：取6支试管，按表1数据配制0～100μg/ml 血清白蛋白液各1ml。
准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm 下比色，绘制标准曲线。
考马斯亮蓝测定蛋白质
植物总蛋白含量测定
植物总蛋白的测定采用Bradford于1976年建立的考马斯亮兰（Coomassie Brilliant
Blue）染色法。
试剂配制：
1考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100毫升85％的磷
酸，用蒸馏水稀释到1升。
2蛋白标准（0.1mg/ml）：
准确称取100.0mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装于
1ml带盖eppendorf管中，-20℃冰箱保存。
3标准曲线绘制（1mg/ml）
按下表操作，在试管中分别加入0、10、20、40、60μl蛋白标准溶液，用水补足到1ml，
加入5ml考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准
蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
编号 1 2 3 4 5 蛋白标准(ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06
蒸馏水(ml) 1.0 0.99 0.98 0.96 0.94
染色液(ml) 5 5 5 5 5 4 称取一定质量的植物组织，研磨后，加入水冲洗至小试管中，后定容至1mL。
加入5ml
考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，根据吸光度和标准曲线测定蛋白质
浓度，然后根据所称质量计算出单位质量植物组织的蛋白质总量。
注：（1）考马斯亮蓝为G-250，不是R-250。
（2）植物组织质量具体称取多少，要通过预实验测定。
一般比色时的吸光度值在
0.2-0.8为宜。
考马斯亮蓝G-250染色法
【实验步骤 实验步骤】
1．组织样品的制备： 准确称取新鲜样品0.பைடு நூலகம்g，用5mL生理盐水在冰 浴中研成匀浆。在3500rpm离心10min，取上清 液待测。 2. 血清样品的稀释 取血清 µl，加生理盐水至
表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.05 （100 µg/mL） 生理盐水（mL） 1.0 0.2 0.8 0.7 0.6 0.5 0.95 G-250试剂（mL） 3 3 3 3 3 3 3 蛋白质含量（µg）0 20 40 60 80 100 吸光度值
结果处理： 1、绘制标准曲线 2、求样品蛋白质浓度
优点： 试剂配制简单、操作简便快捷、灵敏度 高、重复性好、显色迅速、干扰物质较少。 测定范围1-100µg。
【实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂 1、仪器： 722分光光度计、天平、试管、 移液管、离心机
2、试剂： （1）标准牛血清蛋白质溶液： 100 µg/mL牛血清蛋白。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90% 90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸， 100mL 85% W/V 再用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中。常温下可 保存一个月。 （3）生理盐水： 称取0.9g NaCl 加蒸馏水至100ml。
考马斯亮蓝g250染色法考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色原理考马斯亮蓝染色时间考马斯亮蓝染色步骤考马斯亮蓝g250考马斯亮蓝g250配制考马斯亮蓝g250和r250考马斯亮蓝考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-250染色法测定 染色法测定 考马斯亮蓝 蛋白质含量
【实验目的】 学习掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋 白质含量的原理和方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法
测定蛋白质含量
一、目的
1、学习一种蛋白质染色测定的方法
2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具
（一）试剂
1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1ml,5ml）
3、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）标准曲线的制作
1、取7支试管，按下表加入试剂
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定
1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
五、注意事项
1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
六、实验报告
绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。
七、思考题
1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？
2、考马斯亮蓝法有什么优缺点？。