红细胞功能检测方法的研究进展

2! 红细胞免疫功能检测方法
红细胞免疫功能 包括结合 和运送 循环免 疫复合 物至 吞 噬细胞进行清除, 调控和 增强吞 噬细胞 的吞噬 功能, 识别 存 储和提呈抗原, 调控淋巴 细胞应 答及细 胞因子 的释放 等, 而 最主要的免疫功能 是清除 循环免 疫复合 物。检测红 细胞 免 疫功能的方法较多, 多种检测方法的结合则更能客观地 反应 红细胞的免疫功能。 2 1! CR1受体的定量测 定 2 1. 1! 酶联免疫法 ! 2000年, 王海滨等 [ 11] 在国外学者 研究 的基础上建立了 红细 胞 CR1 分子 定量 方法, 其 原理 是采 用 鼠抗人 CR1单抗和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG 二抗, 最终 测定反应孔吸光度值 来反应 CR1受体 的数量。此 方法有 较 好的敏感性和重复性 , 适合在临床进行常规检查。 2 1. 2! 流式细胞仪法 ! 这也是目 前科研中最常用的 1 种技 术。以高能量激光照 射高速流 动状态 下被荧 光色素 染色 的 单细胞或微粒, 测量其产 生的散 射光和 发射荧 光的强 度, 从 而对细胞 (或微粒 ) 的物理、生理、生化、免 疫、遗传、分子 生 物学性状及功能状态 等进行定性或定量检测的技术, 具 有快 速、灵敏、准确、特 异 和同 时进 行 多参 数检 测 等优 点。 C raig 等 [ 12] 用流式细胞仪技术研究 C3b补体调理的免疫复合 物结 合于红细胞非 CR 1受 体位点 后, 免疫 复合 物的 转移 和吞 噬 情况以及与 CR 1受体的作用关系。对 CR 1受体抗体的 荧光 标记方法有通过荧光 标记单克隆 CR1 抗体的直标 法和通 过 单克隆 CR 1抗体 (一抗 )、荧光 标记抗 人 IgG (二 抗 ) 的间 接 法。通过流式细胞仪 计算红细 胞的平 均荧光 强度来 反应 红 细胞 CR 1数目。 2 1. 3! 基因组密 度多 态性测 定方 法 ! S rivastava等 [ 13] 应 用 PCR RFLP技术分 析 CR 1A ( 3650) G R sal基因 多态性在 北印 度人群胆囊癌的遗 传易感 性中所 发挥的 重要作 用。红细 胞 CR1密度高低的表达是由 CR 1基因组内 含子 H ind∃ 酶 切多 态性所决定的 [ 14] 。通过 DNA 提取, PCR 扩 增, 限制 性片 段 长度多态性酶切分析 和琼脂糖凝胶电泳后, 可将 红细胞 CR 1 基因多态性分为 3种: 高、中、低表达型。这种分析方法 对从 基因水平分析 CR 1在 不同年 龄、性别 及病 理状 况下 的表 达 ( 特别是肿瘤的相 关性 ) 具有 重要 意义, 并 有助 于研 究红 细 胞 CR 1基 因 组 表 达 的 家 系 调 查 与 肿 瘤 发 病 易 感 性 的 关 系 [ 15] 。此技术的应用还可用于分析各种形式的 CR 1受体多 态性: 已知分子量的多态性, 红细胞表达 水平、密度多态 性和 K nops( KN ) 多 态 性。 G andhi 等 [ 16] 采 用 此 方 法 研 究 了 CR1K nops多态性在印度人口疟疾 病理生理学中的作用。 2 2! CR1受体调节红细 胞免疫粘附活性 2 2. 1! 红细胞 C3受体花环和免疫 复合物 ( IC )花 环试验 方
法 ! 红细胞 C3受体 花环试验 是依据 RBC 膜 上 C3b受 体可 与 C3b致敏酵母多糖粘附, 并形成花环的原 理, 而 RBC 免疫 复合物花环试验则依 据 RBC 膜粘 附 IC 中 C3b 分子可 与酵 母多糖粘附形成花环的 机理。此 2 种方法 相结 合主要 作为 RBC 免疫粘附功能 的指标。 2 项都低 下则 判为原 发性 红细 胞免疫功能低下, 为 RBC 膜 C3b受 体受到破坏和影响所 致; 如果 RBC C3b受体花 环降 低, 而 RBC IC 花环 率高, 为 继发 性红细胞免疫功 能低 下, 是 C IC 增加, RBC 粘 附 IC 过 多引 起; 若这 2项指标都上 升, 为 红细胞 天然免 疫功 能亢进 与紊 乱 [ 17] 。
通信作者: 汪德清 ( 1962 2 ) , 男, 博士, 主任 医师, 硕士 研究生 导 师, 主要 从 事 临 床 输 血 与 血 液 成 分 代 谢 动 力 学 研 究, 电 话: 010 66936508, Em ai:l deqingw@ vip. sina. com
的红细胞。 2, 3 DPG 含量 的测 定也是 许多 研究 者用以 评价 红细胞携氧能力的 指标 之 一。 1995年, 顾 光煜 等 [ 6] 在 国内 建立了 2, 3 D PG 的比色测定法。 其原理是 2, 3 D PG 被磷酸 甘油酸变位酶 ( PGM ) 水解 为 3 磷酸甘油 酸 ( 3 PGA ) 和无机 磷。用终点比色法测定反应体系中无机磷的生成量, 计算出 2, 3 DPG 的含量。此法最终采用测无机磷的 钼酸铵法, 影响 无机磷测定的因素均影 响本试 验。酶联免 疫法 主要通 过双 抗体夹心法来检测 2, 3 DPG 含量。用 纯化的 抗体包 被微孔 板, 制成固相载体, 向包被有 2, 3 D PG 抗体的 微孔中 依次加 入标本或标准品、生物素化 的 2, 3 DPG 抗体、HRP 标 记的亲 和素, 经过彻底洗 涤后用 底物 TM B 显色。 用酶 标仪测 定吸 光度值, 计算标本浓度。这种方法能更加直接地检测 出标本 中的 2, 3 D PG, 灵敏度 和准 确度都 相对 较高, 但 检测成 本较 高, 不适合于临床常规检测。 1 3! 新型快速显微多道分光光度技术和显微生物医 学图像 分析 技术 ( fast m ulti channe l m icro spec trophotom eter and im ag e ana lysis techniques, FM IA ) ! 此技术建立在 1种特别定制 的倒置显微镜上 ( 5个 成像光 路输出 端口 )。光 路设计 中利 用显微镜侧面输出端口作为显微数字图像成像端口, 利用前 输出端口作为显微多道分光光度检测光路的输入端口, 检测 时使用光路切换装置, 可选择 单条成 像光路 输出, 或几 条光 路相结合同时输 出, 即 可实 现几 种分 析手 段的 同步 联 合检 测。阮萍等 [ 7] 应用此技术对单个活态血红细胞形态结构、弯 曲弹性模量、剪切弹性模量和血红 蛋白吸光度进行联合动态 连续测量。实现了在不同 pH 条件下, 对 RBC 结构和携氧功 能状态发生相应变化的 联合动态 监测。姚 成灿等 [ 8] 也通过 多道分光光度技术测定 了不同环 境温度 下单个 活态红 细胞 内血红蛋白吸收光谱的变化, 得出 人红细胞的携氧能力与温 度密切相关。这种方法从 单个细 胞水平对 红细 胞携氧 功能 进行了研究, 为更准确、全 面评价 红细胞携 氧功 能提供 了方 法依据。 1 4! 激光镊子和显微拉曼光谱相结合的激光镊子拉 曼光谱 ( L ase r tw eeze rs R am an spec tro scopy, LTRS) 技 术 ! 拉 曼 光谱 是 1种反映物质结构的分子振动光谱, 可用于血红蛋 白分子 构象变化研究。该技术可分析单个功能细胞, 并实时 记录由 于环境变化引起的细胞构象变化。激光镊子拉曼光谱系 统, 由二极管激光器、干涉滤波片、反射镜、透镜 、陷波滤波器、双 色镜、针孔、光源、摄像机、偏 振片 组成, 波长 为 780 nm 的激 光经过一系列的反射镜、透镜及干 涉陷波滤波片等到达倒置
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综! 述
中国输血杂志 2010年 8月第 23 卷第 8期 C h in J B lood Transfusion A ug, 2010, V o.l 23, N o. 8
红细胞功能检测方法的研究进展
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
周武 ! 汪德清 (解放军总医 院 输血科 ! 全军临床输血中心, 北京 100853 )
! ! 关键词: 红细胞功能; 检测方 法; 评价指标 ! ! 中图分类号: R 331 1+ 4! R457 1! ! 文献标识码: A! ! 文章编号: 1004 549X ( 2010) 08 0648 03
中国输血杂志 2010年 8月第 23 卷第 8期 C h in J B lood Transfusion A ug, 2010, V o.l 23, N o. 8
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显微镜, 并聚焦 进入 溶液 样品 槽。激 光俘 获 并激 发 单个 细 胞, 产生 的 拉 曼 散 射 沿 着 原 光 路 进 入 光 谱 仪 进 行 检 测。 R am ser等 [ 9] 利用 LTRS系统与微流控技 术相结合, 监测 单个 红细胞的氧 循 环过 程和 光 化学 反应。 D eLuea等 [ 10] 利用 双 光镊拉曼技术研究地中海贫血 红细胞的功能状态。 LTRS 技 术不仅可以模拟功能 红细胞的输氧过程, 而且有望应用 于血 液疾病的诊断和病理 研究。
红细胞是血液中 数目最多的 1类细 胞, 其主要功能 是运 送氧气和二氧化碳, 保障 人体组 织和器 官的正 常供氧, 其 次 是免疫功能。本文着 重总结目 前检测 红细胞 携氧功 能和 清 除循环免疫复合物功 能方法的研究进展。
1! 红细胞携氧功能的检测方法
1 1! 血气分析 仪方法 ! 血 气分析 仪主要 由电 极、管 路及 电 路系统组成。待测标本在管路系统的抽 吸下, 进入测量 毛细 管中, 开口于毛细管管壁上的 pH、pH 参比、PO2 和 PCO 2 4支 电极共同组成对 血液中 pH、PCO2 和 PO2 的检 测系统, 并 将 感测信号转换成各自 的电信号, 经放大转换后传输至计 算机 并进行统计。随着血气分析仪功能的不 断提高, 还具备 了多 种全血检 测 项 目, 通 过 这 些 检 测 项 目 可 计 算 出 SO2 等 指 标 [ 1] 。应用血气分析仪检 测红细 胞携氧 功能的主 要评价 指 标包括 P50、T50、有效携氧量。其中 T50和 有效携氧 量是较 新 的评价 指标。 1)氧解 离动力学参 数 T50检测: 根据血红 蛋白 在高氧分压下与氧 结合, 低氧分 压下与 氧解离 的特性, 在 标 准大气压、正常生理条件 下, 通 过人为 改变血 样的环 境氧 分 压, 监测 标本的 血氧饱 和度与 氧分压随 时间变 化的携 氧 释 氧动力学曲线, 反应红细胞吸收 和释放 O2 的过 程 [ 2]。 2) 有 效携氧量检 测: H am asak i等 [ 3] 通过 计算 有效 携氧 量 的方 法 来评价红细胞携氧 能力的 改变。将标 本红细 胞配制 成一 定 体积的红细胞 悬液, 在标 准大 气压, 37 ∀ 条 件下, 向 悬液 中 通入混合气体, 同时检测溶液中氧分压的变化。待氧分 压达 到并稳定在肺部动脉 血氧分压时, 测定溶液中血红蛋白 的氧 饱和度, 记为 S1。再改变通入气体 的氧分压, 测定 红细胞 悬 液在组织氧分压或肺部 静脉血 氧分压 [ 4] 时血红蛋 白的氧 饱 和度, 记为 S2, 红 细胞的有效携氧量 = 20 # ( S1- S2)。 1 2! 比色法和 酶联免疫法 ! 此 2种方法主要用于 2, 3 二磷 酸甘油酸 ( 2, 3 DPG ) 的检 测。 2, 3 DPG 是 红细 胞糖 酵解 途 径的侧枝循环 2, 3 二磷酸甘油旁路的 中间产物, 是反 映 R BC携氧能 力最 重 要的 指标 [ 5]。 2, 3 二磷 酸 甘油 酸 ( 2, 3 D PG )能特异性地与血红 蛋白 (H b)结合, 降低 血红蛋白 的氧 亲和力, 从而调 节血 红蛋 白氧 的释 放。红 细胞 2, 3 D PG 水 平和携氧量的 关系 为 Y = 0 34X + 3 5, 其中 Y 是 携氧 量, X 是 2, 3 DPG 水平 [ 2] , 调 节 2, 3 DPG 水 平可 能获 得高 携氧 量