重组干扰素的生产 (2)

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人、兽药典中部分干扰素产品总结归纳

人、兽药典中部分干扰素产品总结归纳
2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装与冻干 应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录ⅠA 有关规定。
2.4.3 规格 应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及附录ⅠA有关规 定。
3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定(附录Ⅹ C)。
2.1.3.2 染色镜检 应为典型的革兰氏阴性杆菌。
2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。
2.1.3.4 电镜检查(工作种子批可免做) 应为典型大肠杆菌形态,无支原体、病毒样颗 粒及其他微生物污染。
2.1.3.5 生化反应 应符合大肠杆菌生化反应特性。
2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养,应不低于原始菌种的表达量。
重组人干扰素α1b注射液
本品系由高效表达人干扰素α1b基因的大肠杆 菌,经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人 干扰素α1b制成。含适宜稳定剂,不含防腐剂和
抗生素。
1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具 、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造 2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源 重组人干扰素α1b工程菌株系由带有人干扰素α 1b基因的重组质粒.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录ⅠA 有关规定。
2.4.3 规格 应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及附录ⅠA有关规 定。
3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定(附录Ⅹ C)。
3.1.12 紫外光谱 用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约 100~500μg/ml,在光路1cm、波长230~360nm 下进行扫描,最大吸收峰波长应为278± 3nm (附录ⅡA)。

注射用重组人干扰素α2b说明书

注射用重组人干扰素α2b说明书

注射用重组人干扰素α2b说明书请仔细阅读说明书并在医师指导下使用警示语:1.对重组人干扰素α2b或该制剂的任何成份有过敏史者禁用。

2.患有严重心脏疾病者禁用\。

3.严重的肝、肾或骨髓功能不正常者禁用。

4.癫痫及中枢神经系统功能损伤者禁用。

5.有其他严重疾病不能耐受本品者,不宜使用。

[药品名称]通用名称:注射用重组人干扰素α2b商品名称:利分能英文名称:Recombinant Human Interferon α2b for Injection汉语拼音:Zhusheyong Chongzu Ren Ganraosu α2b[成份]主要成份为重组人干扰素α2b,由高效表达人干扰素α2b基因的腐生型假单孢菌,经发酵、分离和高度纯化制成。

辅料为人血白蛋白、甘露醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。

[性状]应为白色薄壳状疏松体,加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。

[适应症]1.用于治疗某些病毒性疾病,如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣。

2.用于治疗某些肿瘤,如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卡波氏肉瘤、卵巢癌、基底细胞癌、表面膀胱癌等。

[规格]3×106IU/支,复溶后体积1.0毫升。

[用法用量]本品可以肌肉注射、皮下注射和病灶注射。

1.慢性乙型肝炎:皮下或肌肉注射,3—6×106IU/日,连用四周后改为3次/周,连用16周以上。

2.急慢性丙型肝炎:皮下或肌肉注射,3—6×106IU/日,连用四周后改为3次/周,连用16周以上。

3.丁型肝炎:皮下或肌肉注射,4—5×106IU/日,连用四周后改为3次/周,连用16周以上。

4.带状疱疹:肌肉注射,1×106IU/日,连用6天,同时口服无环鸟苷。

5.尖锐湿疣:可单独应用,肌肉注射,1—3×106IU/日,连用四周。

也可与激光或电灼等合用,一般采用疣体基底部注射,1×106IU/次。

重组人干扰素

重组人干扰素

重组人干扰素简介重组人干扰素(recombinant human interferon)是一种由基因重组技术制备的人工合成干扰素。

干扰素是人体自然产生的一类蛋白质,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。

通过基因重组技术,人工合成的重组人干扰素可以在人体内发挥类似自然干扰素的生物学活性,被广泛应用于医学领域的疾病治疗和预防。

组成与结构重组人干扰素的组成与结构与自然干扰素类似,主要由蛋白质组成。

根据不同的干扰素类型,药物名称可能会有所不同,如重组人α干扰素(recombinant human interferon alpha),重组人β干扰素(recombinant human interferon beta)和重组人γ干扰素(recombinant human interferon gamma)等。

重组人干扰素通常采用大肠杆菌等常见微生物进行表达和生产,通过基因重组技术将干扰素基因导入到宿主细胞中,使宿主细胞表达并合成干扰素蛋白质。

制备过程中还可能采用亲和层析、离心、冻干等工艺,保证药物的纯度和稳定性。

作用机制重组人干扰素通过与人体细胞表面的干扰素受体结合,触发一系列信号转导途径,从而发挥其多种生物学活性。

主要的作用机制包括:1.抗病毒作用:重组人干扰素可以激活多种抗病毒机制,如抑制病毒复制、增强细胞免疫反应、诱导干扰素诱导基因和抗病毒蛋白的表达等,从而对多种病毒感染起到抑制和清除的作用。

2.抗肿瘤作用:重组人干扰素可以通过调节宿主免疫系统、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和扩散等机制,对多种恶性肿瘤具有抑制和杀伤作用。

3.免疫调节作用:重组人干扰素可以调节宿主免疫系统的免疫应答,增强细胞免疫和体液免疫功能,对免疫相关性疾病具有治疗和预防作用。

临床应用重组人干扰素在临床应用中已被广泛用于多种疾病的治疗和预防。

以下是一些常见的临床应用:1.丙型肝炎:重组人干扰素可以用于慢性丙型肝炎的治疗,通过抑制病毒复制和增强宿主免疫力来达到治疗效果。

重组人干扰素α2a

重组人干扰素α2a

注射用重组人干扰素α1b从干扰素最初发现到现在已经过去50年,当年英国科学家Isaacs和Lindenmann发现用加热灭活的流感病毒孵育小鸡尿囊绒膜会产生一种物质,它能对肝病毒的感染产生抵抗。

1957年,Proc R Soc Lond B Biol Sci刊登了他们的论文,在这篇论文中,Isaacs和Lindenmann将这种因子命名为干扰素(INTERFERON)。

从1980年代后期开始,借助分子生物学技术的发展,科学家们对干扰素的研究更加深入,各型干扰素、干扰素亚型及其功能逐渐为人们所认识,目前已经确认干扰素三种主要生物学作用为抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。

同时,由于DNA重组技术应用,干扰素制备技术也得到很大提高, 干扰素的研制经历了人白细胞干扰素、重组技术干扰素等阶段。

但在重组DNA技术发展和应用以前,分离纯化工艺的收率较低,而且有潜在病毒污染的危险。

1981年重组DNA技术的成功,提供了一种经济的方法得以产生大量纯化的重组人干扰素。

【1】干扰素是一组多功能的细胞因子,根据其氨基酸结构、抗原性和细胞来源,可将其分为三类:IFN-α, IFN-β和IFN-γ。

α干扰素为多基因产物,分为许多亚型,其中IFN-α1b主要用于抗病毒治疗、抑制和杀伤肿瘤细胞以及免疫调节。

《中国生物制品规程》1995年版开始收载细胞因子类制品,分别是“冻干精制人白细胞干扰素”,“冻干基因工程干扰素α1b”, “冻干基因工程干扰素α2a”。

“冻干精制人白细胞干扰素”是用特定的诱生剂诱导健康人白细胞,经提取后制成的冻干干扰素。

由于该制品生产原料来源困难,工艺复杂,收率低,价格昂贵,并且具有血源性病毒污染的潜在风险,随着基因工程干扰素的出现已被淘汰,《中国生物制品规程》2000年版不再收载该制品。

从《中国生物制品规程》2000年版起,采用重组DNA技术生产的干扰素α1b制品命名为“重组人干扰素α1b”。

基因工程干扰素α1b是通过重组DNA技术将人干扰素α1b的编码基因引入某种工程菌(大肠杆菌)后,高效地表达该基因产物,再经分离、纯化、冻干制得。

重组人干扰素α-2b卡波姆凝胶剂的制备及质量控制

重组人干扰素α-2b卡波姆凝胶剂的制备及质量控制
d n ts t e a s r e c n e c n e tain h a e o ey r t s l 05 a d RS a .6 .Co cu e oe h b o b n y a d C t o c n rt .T e me n r c v r ae wa o . % n D w s 18 % h o n l-
y ed n c u a e c n e t, t b eq a i n e o s i ri blt. il i g a c rt o tn s s l u l y a d z r k n i t i y a t ra l
【 yw rs I r l - b a o e ;Hyrgl rprt ntcnlg ;Q at cnr f ro f r doe;Peaa o h o y u i o t l i e o ly o
ten2 gLad 10mg . i a g sine ut nw s om l e s 007 C 0 12f O 96, h r A w e 0m / n 0 / A l e r r s q ai a r ua da . 8 + . = . 0 )w e L nr e e o o f t A= 0 O8 r 9 e
备工艺可行 , 含量测定方法准确 , 质量稳定 , 对皮肤未见 刺激性 。
【 关键词 】 干扰素 q 2 ;卡波姆;水凝胶;制备工艺;质量控制 一b
P e aain a d q a t o to fc ro r a j vne e o ia th ma nefr n 一 b L n rp r t n u .y cnrlo a b me - du a td rc mb n u n itreo 2 I o n Z A0Ru-i , l i, A Mi-un , UC a- u, I og *eat e tfP am c, hn i d a U H il g X E Yn F N n ga g S h o h iDNG H n.D p r n hr ay Sa x Me i l - n m o c

干扰素的生产工艺

干扰素的生产工艺

药理作用:


1.抗病毒作用:其抗病毒活性不是杀灭而是 抑制病毒,它一般为广谱病毒抑制剂,对 RNA和DNA病毒都有抑制作用。 2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活 性有明显的选择性,对肿瘤细胞的活性比 正常细胞大500~1000倍。干扰素抗肿瘤效 果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖,或通过 宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。
2.预处理-沉淀:

加絮凝剂聚乙烯亚胺:
加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃~10℃,搅拌45min,对菌体碎片进行絮凝。

2℃~10℃,搅拌15min,对菌体碎片、DNA等进行沉 淀。
3.离心:
连续流离心机:2℃~10℃,16000 r/min 收集上清液:含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀:121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
适应症:
1.用于多种恶性肿瘤,包括毛细胞白血 病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓 瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾 癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤 和Kaposi肉瘤等。 2.与其他抗肿瘤药物并用。 3.作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。 4.病毒性疾病的防治。

不良反应:

1.全身反应主要表现为流感样症状,即寒战、 发热和不适。 2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板 和网状红细胞减少。
基因工程假单胞杆菌的构建与保藏



基因工程假单胞杆菌菌种建立: 第一步:干扰素α-2b基因的克隆 第二步:表达载体的构建 第三步:工程菌的构建
第一步:干扰素α-2b基因的克隆
制备白细胞,病毒诱导,分离mRNA,反录酶合 成cDNA,PCR, 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序:编码人IFNα -2b基因序列,501bp, 165aa。

重组人干扰素α1b制造及检定规程

重组人干扰素α1b制造及检定规程

2.6 半成品检定 按3.2项进行。 3.2项进行。 2.7 分装及冻干 按本版规程通则《生物制品分装规程》 按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。 2.8 规格 应为国家药品管理当局批准的规格。 2.9 包装 按本版规程通则《生物制品包装规程》 按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。
3 检定
3.1.11 等电点 为4.0~6.5,批与批之间等电点应一致。 4.0~6.5,批与批之间等电点应一致。 3.1.12 紫外光谱扫描 最大吸收峰波长应为278nm士3nm,批与批之间应 最大吸收峰波长应为278nm士3nm,批与批之间应 一致。 3.1.13 肽图(至少每半年测定1次) 肽图(至少每半年测定1 应符合干扰素α1b的图形,或与对照品图形一致。 应符合干扰素α1b的图形,或与对照品图形一致。 3.1.14 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次) 末端氨基酸序列(至少每年测定1 用氨基酸序列分析仪测定。其N 末端序列应为: Cys用氨基酸序列分析仪测定。其N-末端序列应为: CysAsp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser-Leu-Asp-Asn-ArgAsp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser-Leu-Asp-Asn-ArgArg-Thr-Leu。 Arg-Thr-Leu。
2.2 工程菌菌种 2.2.1工程菌菌种名称及来源 2.2.1工程菌菌种名称及来源 重组人干扰素α1b工程菌株系由人干扰素α1b基因的重组 重组人干扰素α1b工程菌株系由人干扰素α1b基因的重组 质粒转化的大肠杆菌菌株。生产用工程菌株需经国家药品管理 当局批准。 2.2.2 种子批建立、传代及保存 从原始种子批传代、扩增后用适当方法保存,作为主种子 批;从主种子批传代、扩增后用适当方法保存作为工作种子批。 2.2.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.2.3.1 划种LB琼脂平板 划种LB琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长。 2.2.3.2 涂片革兰氏染色 在光学显微镜下观察,应为典型的革兰氏阴性杆菌。

干扰素生产工艺

干扰素生产工艺

干扰素生产工艺干扰素是一种重要的抗病毒蛋白质,广泛应用于临床医学中治疗病毒感染和恶性肿瘤。

干扰素的生产工艺包括基因工程和发酵工艺两个部分。

基因工程是干扰素生产的关键步骤之一。

首先,从人体或其他动物中提取相关基因,然后将其插入到融合质粒或细胞株中。

目前常用的融合质粒是质粒pBR322,细胞株则多选用大肠杆菌(E.coli)。

将外源基因与质粒或细胞株插入时,需要加入特定的限制性内切酶进行剪切,以保证外源基因能够正确插入。

接下来,利用转化法将融合质粒或细胞株引入宿主细胞中,形成重组细胞。

重组细胞经过筛选和分离,最终能够获得具有干扰素基因的细胞株。

发酵工艺是干扰素生产的另一个重要环节。

发酵是利用微生物在合适的培养基中进行代谢活动,生产目标产物。

干扰素的生产主要利用大肠杆菌进行发酵。

首先,将重组细胞培养在含有理想培养基的发酵罐中。

理想的培养基是指含有合适的碳源、氮源、矿物质和辅助因子的培养基,能够提供微生物生长所需的养分。

培养基的pH值、温度和搅拌速度等条件也需要适当控制,以保证微生物能够有效地生长和产生干扰素。

在发酵过程中,需要定期对发酵罐中的微生物进行监测和控制。

通过检测微生物的生长情况、溶氧和酸碱度等参数,可以调整培养条件,以提高干扰素的产量和纯度。

此外,还需要对干扰素进行纯化和浓缩处理。

一般采用柱层析和超滤等技术,将发酵液中的干扰素与其他杂质物进行分离和去除,最终得到较纯的干扰素溶液。

总之,干扰素的生产工艺主要包括基因工程和发酵工艺两个部分。

基因工程通过插入外源基因将干扰素基因引入宿主细胞中,形成重组细胞。

发酵工艺则利用重组细胞在合适的培养基中进行发酵,通过监测和控制微生物的生长条件,最终得到较纯的干扰素产物。

随着生物技术的不断发展,干扰素的生产工艺也在不断优化,以提高产量和纯度,满足临床应用的需求。

大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2a 的发酵工艺

大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2a 的发酵工艺

; 通气量始终 保持
溶解氧在 30% 以上; 通过 流加氨水控 制 pH = 7.0; 通过糖检测试剂盒检测发酵罐中葡萄糖含量。当罐 中原有葡萄糖被耗尽时,开始以 2.5 g· L · h 速度补充葡萄糖, 并逐步增加到 8.5 g· L 此 后 一 直 保 持 在 5 g· L
- 1 - 1 - 1 - 1
tem peratures(SD S -P A G E )
L an e 1 :P rotein m arker;L an e 2: 28 ℃;L ane 3 :3 3 ℃;L an e 4:3 7℃
王思勤, 等 .
大肠杆菌分泌型重组人干扰素 α -2a 的发酵工艺
63 7
用统一的纯化工艺路线; 终产品检测方法及质量标 准符合 《 中国药品生物制品检定规程》 (2000 版) 有 关规定。 1.5 件 大肠杆 菌分 泌型 重组人 IF N α -2a 发酵 基本 条 发酵基本条件的摸索采用摇瓶完成, 通过 SD S -
影响:取 50 m L 摇瓶(带机制档板),分别加入10 m L 表达培养基, 接入种子液, 分别放置于 28℃, 33℃ 及 37℃培 养 (图 1), 说 明发 酵 最 适温 度 为 37℃; ②溶解氧对发酵结果的影响: 分别采用普通摇瓶及 特制内部带有挡板的摇瓶对工程菌进行培养及诱导 表达 (特制内部带有挡板的摇瓶在同样转速下比普 通摇瓶能提供更好的溶解氧, 图 2), 表明高溶解氧 有利于目标蛋白表达; ③pH 值对发酵结果的影响: 取 50 m L 摇瓶 (带机制档板), 分别加入 10 m L 表 达培养基, 接 入种子液, 培养基起 始 pH 值分别 为 6.0、 7.0 和 8.0 (图 3), 表明发酵最适 pH 值为 7.0。 根据上述结果, 本研究确定 IF N α -2a 发酵的基 本条件: 温度 37℃, pH 7.0 左右, 保持较高的溶解 氧, 有利于目的蛋白的表达及分泌。 2.2 发酵培养周期 根据摇瓶实验的结果,结合发 酵其他分泌型工程菌的经验, 本研究确定的分泌型 -2a 的发酵基本条件:温度 37℃, pH 6.5~7.5, IF N α 溶解氧不低于 30% 。在发酵过程中, 定时取样, 通 过镜检监控大肠杆菌生长情况;通过 S D S -P A G E 结 果来确定表达开始时间及表达量, 初步确定分泌型 -2a 的发酵周期为 22 h , 结果见图 4。 IF N α 2.3 中试发酵工艺 通过控制碳 (C ) 源、氮 (N ) 源的流加速度, 很容易控制比生长速率, 减少有机 酸的积累,获得高密度发酵并使目标蛋白高表达,结 果见图 5 和 6。 从多次中试发酵实验结果分析, 分别 补充碳源和氮源优于单补碳源, 结果见表 1。 经优化 后的发酵条件, 光密度达 A 6 0 0 = 70, 分泌型重 组人 -2a 终产品为 120 g· L IF N α 2.2×10 IU · m g 3 讨 论

重组人干扰素生产工艺

重组人干扰素生产工艺

重组人干扰素生产工艺一、简介重组人干扰素(Interferon)是一类重要的免疫调节蛋白,在生物制药领域具有广泛的应用,特别是在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等方面。

重组人干扰素生产工艺是指利用基因工程技术,将人体细胞中制造干扰素的基因导入细菌、真菌或动植物细胞中,并通过发酵、提取等步骤最终制备重组人干扰素的过程。

本文将介绍重组人干扰素生产工艺的关键步骤、技术原理及优化方法。

二、生产工艺步骤1.基因克隆和表达载体构建:–选择适合的重组表达宿主菌,如大肠杆菌、毕赤酵母等。

–将编码重组人干扰素的基因克隆到表达载体中,构建表达载体。

–将表达载体导入宿主菌细胞中,实现干扰素基因的表达。

2.发酵过程:–设计合适的培养基,满足宿主菌的生长和表达需求。

–进行适当的培养条件控制,如温度、pH值、氧气供给等。

–监测培养过程中的生长情况和干扰素的表达水平。

3.重组人干扰素的提取与纯化:–通过离心、超滤等方法将细菌或细胞破碎,释放干扰素。

–采用亲和层析、离子交换层析等技术进行干扰素的纯化和富集。

–进行最终的纯化步骤,得到高纯度的重组人干扰素。

三、关键技术原理•基因克隆:利用PCR扩增目的基因,将其插入适当的表达载体中。

•表达调控:通过调控启动子、转录子等元件来控制干扰素基因的表达水平。

•蛋白质纯化:利用蛋白质的生物特性,如大小、电荷等,选用不同的层析技术进行纯化。

四、工艺优化方法1.菌种优化:选择高表达、稳定的宿主菌株,优化质粒结构。

2.培养条件优化:根据宿主菌的生长情况,调整培养基成分和培养条件。

3.表达调控:利用诱导剂、转录启动子等手段调控干扰素基因的表达水平。

4.提取纯化优化:优化破碎、纯化过程,提高干扰素的产率和纯度。

五、结论重组人干扰素的生产工艺是一项复杂而重要的技术,通过不断优化工艺流程和条件,可以提高干扰素的产量和纯度,满足临床和市场需求。

未来随着基因工程技术的不断发展,重组人干扰素生产工艺将进一步精细化和高效化,为人类健康带来更大的益处。

干扰素的制备

干扰素的制备

把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒 DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行 翻译,对每一个翻译体系的产物进行抗病 毒的干扰素活性检测,经过多轮筛选获得 了产生干扰素的cDNA。 最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表 达载体中,转化大肠杆菌进行高效表达。
二、基因工程干扰素的制备
制备种子液 发酵培养 提 半成品制备 半成品检定 分装 干 成品检定 成品包装 启开种子 粗 冻
1、半成品检定
(4)纯度 纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法,银染显色应 为单一区带,经扫描仪测定纯度应在95%以上。
( 5)相对分子量测定 )
还原型SDS-PAGE,加样量不地域微克,同时用 已知相对分子量的蛋白标准系列做对照,以迁移率为横 坐标,相对分子量的对数为纵坐标作图,计算相对分子 量。与理论值比较,误差不得高于10%。 (6)残余外源性 )残余外源性DNA含量测定 含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定,每剂量中残 余外源性DNA应低于100pg。
(1)物理性状 物理性状
2、成品检定
冻干品白色或微黄色疏松体,加入注射水后 不得含有肉眼可见不溶物。 (2)鉴别试验 鉴别试验 应用ELISA或中和试验检定。 (3)水分测定 水分测定 用卡氏法,应低于3%。 (4)无菌试验 无菌试验 同半成品。
(5)热原质试验 热原质试验 同半成品检定。 (6)干扰素效价测定 干扰素效价测定 同半成品检定,效价不应低于标示量。 (7)安全试验 安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只,每只腹侧皮下注 射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍,观察7 天,若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降,说明 成品合格。 取体重18-20克小鼠5只,每只尾静脉注射剂量按 人每千克体重临床使用最大量的3倍,观察7天,若动 物全部存活,说明成品合格。

聚乙二醇修饰干扰素_2b的分离纯化和制备

聚乙二醇修饰干扰素_2b的分离纯化和制备

中 国 药 科 大 学 学 报Jo ur nal of China Pharm aceutical University 2001,32(3):310~312聚乙二醇修饰干扰素 2b的分离纯化和制备林碧蓉,姚文兵*,沈子龙,吴梧桐(中国药科大学生物制药学院,南京210009)摘 要 目的 建立聚乙二醇修饰干扰素 2b的分离纯化方法。

方法 运用Superdex75Hig hlo ad制备型凝胶色谱柱,以含0.15mo l/L N aCl的0.01mo l/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,流速为1.5ml/min,检测波长为215 nm。

结果 各洗脱组分经SDS-P A GE检测呈单一条带。

聚乙二醇修饰干扰素 2b的蛋白回收率为36.5%,抗病毒活性回收率为4.3%,比活度为4.74×107IU/mg,是原形干扰素 2b的10.4%。

结论 这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素 2b。

关键词 干扰素 2b;聚乙二醇修饰干扰素 2b;分离纯化中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1000-5048(2001)04-0310-19 干扰素是人或动物细胞在病毒或其他抗原诱导下产生的一类糖蛋白。

目前,临床上应用最为广泛的是干扰素 2b,主要用于治疗慢性肝炎和毛细胞性白血病等病毒性疾病和肿瘤[1]。

但是,人重组干扰素 2b不具有天然干扰素的糖基化结构,生物半衰期短,产生中和抗体高,大大限制了其临床应用。

聚乙二醇修饰技术能够增强蛋白质类药物的稳定性,提高生物利用度,降低免疫原性。

目前,应用这项技术进行修饰的蛋白质类药物有天冬酰胺酶,超氧化物歧化酶,白介素-2等[2]。

本文利用制备型高效液相色谱技术,对单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯( -methoxy-po lyethy lene gly col- -N-succinim idyl carbonate,SC-mPEG)修饰干扰素 2b反应液进行分离、纯化,获得聚乙二醇修饰干扰素 2b。

重组人干扰素α_(2a)涂剂的研制

重组人干扰素α_(2a)涂剂的研制

重组人干扰素α_(2a)涂剂的研制
石晓丽;万里;张雪梅;姜巍
【期刊名称】《中国医药工业杂志》
【年(卷),期】2001(32)7
【摘要】研究了重组人干扰素α2 a涂剂的制备方法,进行了稳定性、皮肤过敏性、皮肤急性毒性等试验。

结果表明 ,本品性质稳定 ,2~10°C保存 12个月后生物学
活性无明显下降 ,使用安全。

【总页数】3页(P302-303)
【关键词】重组人干扰素α2a涂剂;皮肤刺激性;皮肤急性毒性;研制;制剂
【作者】石晓丽;万里;张雪梅;姜巍
【作者单位】长春生物制品研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R744.21;TQ464.9
【相关文献】
1.重组人干扰素α2a注射剂评价性抽验结果与质量分析 [J], 裴德宁;郭莹;李永红;
韩春梅;丁有学;李响;饶春明
2.外用重组人干扰素α2a凝胶剂研究 [J], 郭秀侠;董义兰
3.论重组人干扰素α2a凝胶剂的制备与检测 [J], 王颖;高波
4.重组人干扰素α-2a聚氰基丙烯酸丁酯肝靶向缓释纳米球冻干剂的研究 [J], 陆彬;奉建芳;杨秀岑
5.重组人干扰素α2a凝胶剂的制备 [J], 张淑子;张京兰;董义兰
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题目浅析重组干扰素的生产姓名杨胜德学号11113173专业生物工程学院微生物指导教师鞠守勇二零一二年十一月目录摘要﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 关键词﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Abstract﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Key words﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 前言﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.基因工程菌的构建﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.1目的基因的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.1.1干扰素mRNA的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.1.2 cDNA的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.1.3 cDNA第二链的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1.2 大肠杆菌质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1.3重组质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1.3.1重组质粒的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1.3.2 重组DNA的转化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1.3.3重组体的筛选与鉴定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍52.目的基因的表达﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍53.产物的提取与纯化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍54.质量控制和要求﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6 4.1半成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍64.2成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍65.参考文献﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍76.致谢﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍8浅析重组干扰素的生产·摘要干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白),是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。

具有广谱的抗病毒、影响细胞生长,以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

·关键词干扰素;基因重组;质粒Briefly Analysis of recombinant interferon productionAbstractInterferon is a group with multiple functions of active protein (mainly glycoprotein), is a kind of monocytes and lymphocytes cytokines. It has broad-spectrum antiviral, effect of cell growth, differentiation, and modulation of immune function and other biological activity.Key wordsInterferon,gene recombinant, plasmid前言干扰素(IFN)是人体细胞分泌的一种活性蛋白[1],具有广泛的抗病毒,抗肿瘤和免疫调节活性,是人体防御系统的重要组成部分。

早期的干扰素是用病毒诱导人白血球(白细胞)产生的,产量低,价格昂贵,根本不能满足需要。

现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来进行生产。

一般选用大肠杆菌作为受体菌[2],利用pBR322质粒作为载体进行干扰素的生产。

pBR322质粒是目前在基因工程中研究得最多,使用最早且应用最广泛的一种大肠杆菌质粒。

此载体有两个标记基因,分别为抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Ampr),在氨苄青霉素基因内部有ScaⅠ,Pv uⅠ,PstⅠ三种限制性内切酶位点,外源基因的插入会引起插入失活,因此可以筛选出抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌来克隆。

干扰素根据其分子结构和抗原性的差异可分为α、β、γ、ω4个类型[3],通常分为三种。

Ⅰ型:有IFN-α和IFN-β,其中IFN-α有二十余个亚型,IFN-β仅有一个亚型。

Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等用。

Ⅱ型:只有IFN-γ,且只有一种亚型,除具有抗病毒、抗增殖活性外,其主要生物学活性为免疫调节作用。

Ⅲ型:即IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)和IFN-λ(IL-28b)。

IFN-ω属于IFN-α家族,其结构和大小与其它IFN-α稍有差异,但抗原性有较大的不同。

1.基因工程菌的构建1.1目的基因的获取在干扰素重组DNA成功以前,人们对干扰素的结构一无所知,因此不能人工合成基因,而且人染色体上干扰素基因拷贝数极少(大约只有1.5%),加上提取上的困难,所以不能直接分离干扰素的基因,而是通过mRNA反转录成cDNA[4]1.1.1干扰素mRNA的获取通过诱生的白细胞或成纤维细胞,提取全RNA。

方法是在高速的离心机上以10000r/min 离心1min。

因为mRNA 3’末端含有polyA结构,即含有大量的寡聚腺嘌呤,所以可以寡dT-纤维素柱层析来获取mRNA,用低盐溶液和蒸馏水洗脱,经5%蔗糖密度梯度离心提取12SmRNA。

1.1.2 cDNA 的合成由于cDNA有3’poly末端,可用寡聚(dt)作引物,在反转录酶的催化下,开始cDNA 的合成。

往往在合成的过程中加入一种放射性标记的dNTP,在反应后通过测定放射性标记的dNTP的渗入量,;来计算cDNA的合成效率,在凝胶电泳后,进行放射自显影分析产物分子的大小,探索最佳的反应条件。

一次好的反转录反应可使寡聚(dt)选出的mRNA有5%-30%被合成cDNA。

1.1.3 cDNA 第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链,然后以cDNA第一链为模板来合成cDNA的第二链。

由于第一条cDNA链3’末端往往会形成一个发卡结构,所以,可用DNA聚合酶Ⅰ从这一点开始催化合成cDNA第二链。

最后用核酶SⅠ专一性切除发夹形结构。

1.2 大肠杆菌质粒获取取大肠杆菌培养液3ml于微量离心管,以10000r/min离心1min,去掉上清液后,用滤纸吸干残液,加入100µl溶液Ⅰ(葡萄糖,Tris-cl,EDTA,PH=8.0),吹散菌株后置冰上5min。

加入200µl溶液Ⅱ(NaOH,1%SDS)轻柔颠倒后混匀,置冰山5min,再加上150µl溶液Ⅲ(醋酸钾,醋酸),混匀后置冰上5min。

然后在4℃,12000r/min离心5min,吸取上清液至另一离心管,再加两倍体积预冷的无水乙醇,混匀后置冰上5min,接着再4℃、12000r/min离心5min,弃去上清,加800µl 70%乙醇漂洗,弃上清液,除尽乙醇后自然风干[5]。

1.3重组质粒的获取1.3.1重组质粒的合成在体外用PstⅠ酶切割pBR322质粒,使其产生黏性末端,再用PstⅠ酶切割目的基因,使它们获得相同的黏性末端,然后用DNA连接酶连接磷酸二酯键[6]。

1.3.2重组DNA的转化重组质粒在完成体外构建之后,必须导入到合适的受体细胞中,这样目的基因才能实现扩增,纯化和表达等,把以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入到受体细胞的过程称为转染(transfection)[7]。

一般细菌在感受态(competence)能从周围环境中摄取DNA分子,而细菌不是在任何情况下都能产生感受态的,所以可采用人工的方法诱导感受态的产生,常用的有氯化钙转化法和电转化法。

利用钙离子和改变温度的方法,使重组质粒进入到受体细胞-大肠杆菌。

1.3.3重组体的筛选、鉴定由于pBR322质粒PstⅠ酶识别位点位于抗氨苄青霉素(Ampr)内部(如图)[8],故插入目的基因后,会引起插入失活,失去抗氨苄青霉素的能力,不能在含有氨苄青霉素培养基中生长,但由于pBR322质粒有抗四环素基因(Tcr),故可在含有氨苄青霉素的培养基中生长。

将重组菌体充分稀释后滴到多孔板上培养,可以认为每个多孔板均为单菌落。

向分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基上滴加菌体,筛选出能在四环素上生长而不能在氨苄青霉素上生长的菌体。

●2目的基因的表达人干扰素α2b(以α2b为例)基因工程菌为SW-IFN α2b/E.coli DH5,质粒用Pl启动子,含氨苄青霉素抗性基因。

种子培养基含蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5%、Nacl 0.5%.分别接种人干扰素α2b基因工程菌到四个装有1000ml三角瓶中,30℃摇床培养10h,作为发酵种子使用。

用装有10L发酵液的15L发酵罐进行发酵,发酵培养基由蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5% 、NH4CL0.01%、NaCl 0.05%、Na2HPO4 0.6%、CaCl2 0.001% 、KH2PO4 0.3% 、MgSO4 0.01%、葡萄糖0.4%、氨苄青霉素50㎎/ml及少量防泡剂组成,PH6.8。

诱导转速500r/min,通气量为1:1vvm,溶氧为50%。

30℃发酵8h,然后在42℃下诱导2~3小时即可完成发酵。

[9]●3产物的提取与纯化发酵完毕冷却后进行4000r/min离心30min,除去上清液,得湿菌体1000g左右。

取100g 湿菌体重新悬浮于500ml 20mol/L磷酸缓冲液中(PH7.0),于冰浴条件下进行超声破碎。

然后以4000r/min离心30min。

取沉淀部分,用100ml8mol/L尿素溶液,20mmol/L磷酸缓冲液(PH7.0),0.5%mmol/L二硫基苏糖醇室温搅拌抽提2h,15000r/min离心30min。

取上清液用同样的缓冲液稀释尿素浓度为0.5mol/L,加二硫基苏糖醇至0.1mmol/L,4℃搅拌15h,15000r/min离心30min除去不容物。

上清液经截流相对分子质量为10000的中空纤维超滤器浓缩,将浓缩的人干扰素α2bε溶液经过Sephadex G-50分离[10],层析柱2㎝×100㎝,先用20mmol/L磷酸缓冲液(PH7.0)平衡,上柱后用同一缓冲液洗脱分离,收集人干扰素α2b部分,经SDS-PAGE检查。

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