重组干扰素的生产 (2)

题目浅析重组干扰素的生产

姓名杨胜德学号11113173

专业生物工程学院微生物

指导教师鞠守勇

二零一二年十一月

目录

摘要﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 关键词﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Abstract﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Key words﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 前言﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.基因工程菌的构建﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1目的基因的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.1干扰素mRNA的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.2 cDNA的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.3 cDNA第二链的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．2 大肠杆菌质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3重组质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.1重组质粒的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.2 重组DNA的转化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.3重组体的筛选与鉴定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

2.目的基因的表达﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

3.产物的提取与纯化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

4.质量控制和要求﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6 4.1半成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6

4.2成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6

5.参考文献﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍7

6.致谢﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍8

浅析重组干扰素的生产

·摘要

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

·关键词

干扰素；基因重组；质粒

Briefly Analysis of recombinant interferon production

Abstract

Interferon is a group with multiple functions of active protein (mainly glycoprotein), is a kind of monocytes and lymphocytes cytokines. It has broad-spectrum antiviral, effect of cell growth, differentiation, and modulation of immune function and other biological activity.

Key words

Interferon,gene recombinant, plasmid

前言

干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白[1]，具有广泛的抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。早期的干扰素是用病毒诱导人白血球（白细胞）产生的，产量低，价格昂贵，根本不能满足需要。现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来进行生产。

一般选用大肠杆菌作为受体菌[2]，利用pBR322质粒作为载体进行干扰素的生产。pBR322质粒是目前在基因工程中研究得最多，使用最早且应用最广泛的一种大肠杆菌质粒。此载体有两个标记基因，分别为抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Ampr），在氨苄青霉素基因内部有ScaⅠ,Pv uⅠ,PstⅠ三种限制性内切酶位点，外源基因的插入会引起插入失活，因此可以筛选出抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌来克隆。

干扰素根据其分子结构和抗原性的差异可分为α、β、γ、ω4个类型[3]，通常分为三种。Ⅰ型：有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等用。Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用。Ⅲ型：即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）和IFN-λ（IL-28b）。IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。

1.基因工程菌的构建

1.1目的基因的获取

在干扰素重组DNA成功以前,人们对干扰素的结构一无所知,因此不能人工合成基因,而且人染色体上干扰素基因拷贝数极少(大约只有1.5%),加上提取上的困难,所以不能直接分离干扰素的基因,而是通过mRNA反转录成cDNA[4]

1．1.1干扰素mRNA的获取

通过诱生的白细胞或成纤维细胞，提取全RNA。方法是在高速的离心机上以10000r/min 离心1min。因为mRNA 3’末端含有polyA结构，即含有大量的寡聚腺嘌呤，所以可以寡dT-纤维素柱层析来获取mRNA，用低盐溶液和蒸馏水洗脱，经5%蔗糖密度梯度离心提取12SmRNA。

1.1.2 cDNA 的合成

由于cDNA有3’poly末端,可用寡聚（dt）作引物，在反转录酶的催化下，开始cDNA 的合成。往往在合成的过程中加入一种放射性标记的dNTP，在反应后通过测定放射性标记的dNTP的渗入量，；来计算cDNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物分子的大小，探索最佳的反应条件。一次好的反转录反应可使寡聚（dt）选出的mRNA有5%-30%被合成cDNA。

1.1.3 cDNA 第二链的合成

先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板来合成cDNA的第二链。由于第一条cDNA链3’末端往往会形成一个发卡结构，所以，可用DNA聚合酶Ⅰ从这一点开始催化合成cDNA第二链。最后用核酶SⅠ专一性切除发夹形结构。

1.2 大肠杆菌质粒获取

取大肠杆菌培养液3ml于微量离心管，以10000r/min离心1min，去掉上清液后，用滤