重组干扰素的生产 (2)

题目浅析重组干扰素的生产

姓名杨胜德学号11113173

专业生物工程学院微生物

指导教师鞠守勇

二零一二年十一月

目录

摘要﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 关键词﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Abstract﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Key words﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 前言﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.基因工程菌的构建﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1目的基因的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.1干扰素mRNA的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.2 cDNA的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.3 cDNA第二链的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．2 大肠杆菌质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3重组质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.1重组质粒的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.2 重组DNA的转化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.3重组体的筛选与鉴定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

2.目的基因的表达﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

3.产物的提取与纯化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5

4.质量控制和要求﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6 4.1半成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6

4.2成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6

5.参考文献﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍7

6.致谢﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍8

浅析重组干扰素的生产

·摘要

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

·关键词

干扰素；基因重组；质粒

Briefly Analysis of recombinant interferon production

Abstract

Interferon is a group with multiple functions of active protein (mainly glycoprotein), is a kind of monocytes and lymphocytes cytokines. It has broad-spectrum antiviral, effect of cell growth, differentiation, and modulation of immune function and other biological activity.

Key words

Interferon,gene recombinant, plasmid

前言

干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白[1]，具有广泛的抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。早期的干扰素是用病毒诱导人白血球（白细胞）产生的，产量低，价格昂贵，根本不能满足需要。现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来进行生产。

一般选用大肠杆菌作为受体菌[2]，利用pBR322质粒作为载体进行干扰素的生产。pBR322质粒是目前在基因工程中研究得最多，使用最早且应用最广泛的一种大肠杆菌质粒。此载体有两个标记基因，分别为抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Ampr），在氨苄青霉素基因内部有ScaⅠ,Pv uⅠ,PstⅠ三种限制性内切酶位点，外源基因的插入会引起插入失活，因此可以筛选出抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌来克隆。

干扰素根据其分子结构和抗原性的差异可分为α、β、γ、ω4个类型[3]，通常分为三种。Ⅰ型：有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等用。Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用。Ⅲ型：即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）和IFN-λ（IL-28b）。IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。

1.基因工程菌的构建

1.1目的基因的获取

在干扰素重组DNA成功以前,人们对干扰素的结构一无所知,因此不能人工合成基因,而且人染色体上干扰素基因拷贝数极少(大约只有1.5%),加上提取上的困难,所以不能直接分离干扰素的基因,而是通过mRNA反转录成cDNA[4]

1．1.1干扰素mRNA的获取

通过诱生的白细胞或成纤维细胞，提取全RNA。方法是在高速的离心机上以10000r/min 离心1min。因为mRNA 3’末端含有polyA结构，即含有大量的寡聚腺嘌呤，所以可以寡dT-纤维素柱层析来获取mRNA，用低盐溶液和蒸馏水洗脱，经5%蔗糖密度梯度离心提取12SmRNA。

1.1.2 cDNA 的合成

由于cDNA有3’poly末端,可用寡聚（dt）作引物，在反转录酶的催化下，开始cDNA 的合成。往往在合成的过程中加入一种放射性标记的dNTP，在反应后通过测定放射性标记的dNTP的渗入量，；来计算cDNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物分子的大小，探索最佳的反应条件。一次好的反转录反应可使寡聚（dt）选出的mRNA有5%-30%被合成cDNA。

1.1.3 cDNA 第二链的合成

先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板来合成cDNA的第二链。由于第一条cDNA链3’末端往往会形成一个发卡结构，所以，可用DNA聚合酶Ⅰ从这一点开始催化合成cDNA第二链。最后用核酶SⅠ专一性切除发夹形结构。

1.2 大肠杆菌质粒获取

取大肠杆菌培养液3ml于微量离心管，以10000r/min离心1min，去掉上清液后，用滤

纸吸干残液，加入100μl溶液Ⅰ（葡萄糖，Tris-cl，EDTA,PH=8.0），吹散菌株后置冰上5min。加入200μl溶液Ⅱ（NaOH,1%SDS）轻柔颠倒后混匀，置冰山5min,再加上150μl溶液Ⅲ（醋酸钾，醋酸），混匀后置冰上5min。然后在4℃，12000r/min离心5min，吸取上清液至另一离心管，再加两倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置冰上5min，接着再4℃、12000r/min离心5min，弃去上清，加800μl 70%乙醇漂洗，弃上清液，除尽乙醇后自然风干[5]。

1.3重组质粒的获取

1．3.1重组质粒的合成

在体外用PstⅠ酶切割pBR322质粒，使其产生黏性末端，再用PstⅠ酶切割目的基因，使它们获得相同的黏性末端，然后用DNA连接酶连接磷酸二酯键[6]。

1.3.2重组DNA的转化

重组质粒在完成体外构建之后，必须导入到合适的受体细胞中，这样目的基因才能实现扩增，纯化和表达等，把以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入到受体细胞的过程称为转染（transfection）[7]。一般细菌在感受态（competence）能从周围环境中摄取DNA分子，而细菌不是在任何情况下都能产生感受态的，所以可采用人工的方法诱导感受态的产生，常用的有氯化钙转化法和电转化法。利用钙离子和改变温度的方法，使重组质粒进入到受体细胞-大肠杆菌。

1.3.3重组体的筛选、鉴定

由于pBR322质粒PstⅠ酶识别位点位于抗氨苄青霉素（Ampr）内部（如图）[8]，故插入目的基因后，会引起插入失活，失去抗氨苄青霉素的能力，不能在含有氨苄青霉素培养基中生长，但由于pBR322质粒有抗四环素基因（Tcr），故可在含有氨苄青霉素的培养基中生长。将重组菌体充分稀释后滴到多孔板上培养，可以认为每个多孔板均为单菌落。向分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基上滴加菌体，筛选出能在四环素上生长而不能在氨苄青霉素上生长的菌体。

●2目的基因的表达

人干扰素α2b（以α2b为例）基因工程菌为SW-IFN α2b/E.coli DH5,质粒用Pl启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5%、Nacl 0.5%.分别接种人干扰素α2b基因工程菌到四个装有1000ml三角瓶中，30℃摇床培养10h，作为发酵种子使用。用装有10L发酵液的15L发酵罐进行发酵，发酵培养基由蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5% 、NH4CL0.01%、NaCl 0.05%、Na2HPO4 0.6%、CaCl2 0.001% 、KH2PO4 0.3% 、MgSO4 0.01%、葡萄糖0.4%、氨苄青霉素50㎎/ml及少量防泡剂组成，PH6.8。诱导转速500r/min，通气量为1:1vvm，溶氧为50%。30℃发酵8h，然后在42℃下诱导2~3小时即可完成发酵。[9]

●3产物的提取与纯化

发酵完毕冷却后进行4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌体1000g左右。取100g 湿菌体重新悬浮于500ml 20mol/L磷酸缓冲液中（PH7.0），于冰浴条件下进行超声破碎。然后以4000r/min离心30min。取沉淀部分，用100ml8mol/L尿素溶液，20mmol/L磷酸缓冲液(PH7.0)，0.5%mmol/L二硫基苏糖醇室温搅拌抽提2h，15000r/min离心30min。取上清液用同样的缓冲液稀释尿素浓度为0.5mol/L，加二硫基苏糖醇至0.1mmol/L，4℃搅拌15h，15000r/min离心30min除去不容物。上清液经截流相对分子质量为10000的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素α2bε溶液经过Sephadex G-50分离[10]，层析柱2㎝×100㎝，先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素

α2b部分，经SDS-PAGE检查。将Sephadex G-50柱分离的人α2b组分，再经DE-52柱（2㎝×50㎝）纯化，上柱后用含0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液（PH7.0）分别洗涤，收集含人干扰素α2b的洗脱液。全过程蛋白质回收率为20%至25%，产品不含杂蛋白，DNA及热源物资质量合格。

4质量控制和要求

4.1半成品检定

①干扰素效价的测定：用细胞病变抑制法[11]，Wish细胞，VSV病毒为基本检测系统。测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。

②蛋白质含量测定：用Folin-酚试剂法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白作标准。

③比活性：干扰素效价的国际单位与蛋白含量的毫克数之比即为比活性。

④纯度测定：电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，用银染色法显色，应为单一区带，经扫描仪扫描纯度应该在95%以上。在非还原电泳上允许有少量聚合体存在，但不得超过10%。用高效液相色谱反相柱或GPC测纯度，应呈一个吸收峰，或主峰占总面积95%以上。

⑤相对分子质量测定：用还原型SDS-PAGE法，加样量不低于5g，同时用已知相对分子质量的蛋白标准系列作对照，以迁移率为横坐标，相对分子质量的对数为纵坐标作图，计算相对分子质量，再与干扰素理论值比较，其误差不得高于10%。

⑥残余外源性DNA的测定：用同位素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA 含量应低于100pg。

⑦残余血清IgG含量测定：在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。如应用鼠杂交瘤单克隆抗体时应测定鼠IgG的含量，可用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20g）的鼠IgG的含量应在100ng以下[12]。

⑧残余抗生素活性：凡在菌种传代过程中使用抗生素者，均应测定相应抗生素活性，半成品中不应有抗生素活性存在。

⑨紫外光谱扫描：检查半成品的光谱吸收值，用全自动扫描紫外分光光度计观察紫外光范围

⑩内光谱图，最大吸收值应为280nm±2nm。

○11肽图测定：CNBr裂解法，应符合干扰素的结构，批与批之间肽图应一致。

等电点测定：用等电点聚焦电泳法测定，批与批之间等电点应完全相同。

○12除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热源试验。

4.2成品检定

①物理性状：冻干制品外观应为白色或微黄色疏松体，加入注射水后，不得含有肉眼可见的不溶物。

②鉴别试验：应用ELISA法或中和试验鉴定。

③水分测定：用卡氏法，应低于3%。

④无菌试验：同半成品检定。

⑤热源试验：同半成品检定。

⑥干扰素效价测定：同半成品检定，效价不低于标示量。

⑦安全试验：取体重350~400g豚鼠3只，每只腹侧皮下注射人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7d，局部无红肿、坏死、总体重不下降者为合格。取体重18~20g小鼠5只，每只尾静脉注射人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7d，动物全部存活者为合格。

参考文献

[1] 夏焕章.生物技术制药.北京：高等教育出版社,2006

[2] 杨汝德.基因克隆在制药中的应用.北京：化学工业出版社,2004

[3] 陈惠鹏 .医药生物工程进展 .北京:人民军医出版社，2004

[4] 卢锦汉，章以浩，赵凯。医药生物制品学。北京:人民卫生出版社，1995

[5] 汪峻.基因操作技术华中师范大学出版社,2010

[6] 朱玉贤，李毅，郑晓峰.现代分子生物学.北京：高等教育出版社，2007

[8] 李育阳.基因表达技术.北京：科学出版社，2001

[9] 张克旭.抗生素发酵工艺学.北京:中国轻工业出版社,2006

[10] 毛忠贵.生物工业下游技术.北京:中国轻工业出版社,2004

[11] 杨贵贞.医学免疫学.北京:高等教育出版社,2002

[12] 周正任.抗体工程.微生物学杂志，1996,(16)

鸣谢

此次论文能够顺利的完成并达到理想的结果,我要真诚的感谢鞠守勇老师的悉心指导和帮助。鞠老师创新的实验思维、大胆的实验设计和刻苦钻研的实验精神都使我受益颇多，也是我实验圆满完成的坚强后盾。感谢他在学术上给我耐心的指导和帮助，培养了我浓厚的科研兴趣，使我明确了今后努力的方向；在生活上，鞠守勇老师积极乐观，不断追求的精神风貌也给我很大的启迪；在做事方面，培养了我严谨的态度和大胆追求的精神。在他的身上，我看到了科研工作者所特有的那股精神，这对我起到了积极影响，使我终身受益。另外还要感谢和我一起合作努力的同学，谢谢你们真诚的帮助。