琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用

Tris—磷酸 （TPE）
1×：0.09moL/L Tris—磷酸 0.002moL/L EDTA
Tris—硼酸 （TBE）
0.5×0.045moL/L Tris—硼酸 0.001moL/L EDTA
加样缓冲液
缓冲液类型 I 6×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 贮存温度 4℃
2、胶床准备
①取出胶床和梳齿，将梳子垂直插入到胶床的小凹槽 内，梳齿底端和床面有一定的间隙 ③将胶床放在调整好的水平台上
3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶
床内，凝胶厚度3～5mm（注意在胶床的一个角落倒胶， 同时不能间断，防止倒胶不均或产生气泡；一旦产生气泡， 立即用枪头小心挑出） 4、室温下静置半小时左右，凝胶固化。 将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场 负极 5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳齿。 6、向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越 过凝胶表面即可
7、样品准备：手套上向核酸样品中加入6*的上样缓冲液， 用加样器轻轻混匀。样品上10 ul，缓冲液上2 ul。
8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般小于20 μl 9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压120v；时间0.5小时左右，置于碎冰中
常用的电泳缓冲液的配制
缓冲液 使用液 浓贮存液（每升）
Tris—乙酸 （TAE）
1×：0.04moL/L Tris—乙酸 0.001moL/L EDTA
50×：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)
10×：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 5×：54g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)
电泳缓冲液
电泳缓冲液是指在进行电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系 酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。
作用 ：
①缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负 极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应，负极发生的是还原反 应，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有 较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变。 ②电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分 子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的钠离子 ，钠离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使 胶发热甚至熔化。 ③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯 合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止镁离子与核酸 生成沉淀。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分离
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 与蛋白质分子相似，核酸分子也是两性解离分子， 在pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸根全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。
分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳 分子所携带的净电荷数成正比。不同大小和构象的核 酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时各核酸分 子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适当浓度 的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使 得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异， 达到分离目的，在loading buffer的作用下，可观察 电泳的进行情况。
II
0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）
室温
III
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4℃
IV
4℃
V （碱性加样缓冲液）
300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 0．15%溴甲酚绿 0．25%二甲苯青FF
溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料， 它在紫外灯照射下能发射荧光，当 DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时， 琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子 中形成荧光络合物，使DNA发射的 荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫 外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
电泳缓冲液的组成
1. Tris—乙酸（TAE） 2. Tris—硼酸（TBE） 3. Tris—磷酸（TPE） 其浓度约为50mmoL/L，这些缓冲液均含有 EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于 室温。
10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带 ②摄影记录
Dye :与样品结合并使其显一定的颜色以指 示样品在凝胶中所处的位置。
DNA：Ethidium Bromide, EB(溴乙啶)
inlayed into DNA double strands.
10ng Argent(银试剂) Ag+ very sensitive 0.5ng
垂板电泳槽
转移电泳槽
平板电泳槽
双向电泳槽
电泳操作步骤
1、凝胶准备 用1×TAE配制1.2％琼脂糖凝胶。
① 称1.2 g琼脂糖置三角瓶中，加100ml，1×TAE ② 微波炉加热大约1-2分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时（手掌轻触感觉 热但是刚能够承受），加入EB，5μl（10 mg/ml），并 轻轻混匀
4℃
• 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入 样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作 更为便利。 • 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
特点：
①TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实 际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子 质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%， 电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外， 回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量 小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲 液得到交换。 ②TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳 小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗 作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合 物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 ③TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以 也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。