乙型肝炎病毒cccDNA培训课件

乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 组 结 构 示 意 图
乙 型 肝 炎 病 毒 的 复 制 过 程
我们为什么要关注HBV cccDNA?
cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的Biblioteka Baidu制“池
”
目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA
的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一
二、HBV cccDNA检测技术
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
现有的几种cccDNA检测技术简介
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
2.侵入者探针法(Invader assay)
两个体系：
两 种 特 殊 的 探 针 ： invader probe 和 primary probe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。
荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ (cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第 二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合 ，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光 信号。
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
与定性法比较增加了一个荧光探 针，探针位于扩增片段区（负链缺口 下游），与cccDNA的负链互补。
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
3200(1) 3‘
EcoR I
+
P2
1590 P1
5‘ 5‘
3‘ 1820
rcDNA不能被扩增
无荧光信号
3200（1） EcoR I
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
缺陷： ·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA
非特异性扩增的问题 ·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普
通PCR更高
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
质粒标准品107copy/ml 质粒标准品105copy/ml 3.5×108copy/ml携带者血清 105~107copy/ml携带者血清
+
P2
1590 P1
1820
cccDNA能被扩增 检测到荧光信号
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ： 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
乙型肝炎病毒cccDNA
一、几个相关问题简介
什么是HBV cccDNA?
即 共 价 闭 合 环 状 DNA （ covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿 主细胞后在细胞内复制并建立感染状态， 病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核， 利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形 成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。
特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结 合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧 光信号，呈线性信号放大
侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点
优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强
缺点：灵敏度低：104copy/ml
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） 嵌合引物荧光PCR法
肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏
移植术后乙肝复发的来源
还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世
为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?
·研究和开发该检测技术的时间不长 ·检测技术上的难度较大 ·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏
模，不能满足临床检验的需求 ·现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy
1.选择性PCR
设计一对特殊引物：跨双缺口引物
正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游
反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负 链缺口下游
目的：rcDNA不被扩增
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一 失
PCR产物自身退火（self annealing）
/ml左右 ·分研究机构和学者对检测技术的特异性认
识不足，存在缺陷
建立cccDNA检测技术必须克服的难点
·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA
·如何进一步解决特异性的问题？ ·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA
“选择性”PCR：并非万无一 Kock等：反应管中rcD失NA含量不能超过105copy
Hepatology 1996;23:405-413
血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR 可能会出现检测结果假阳性
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结 果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA
采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA
采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
含量的较低），血清中含量？ ·如何简化检测步骤？
分离cccDNA和rcDNA的分子基础
cccDNA
rcDNA
核酸一级结构
完整的双链
两条链均不完整
核酸空间结构 闭合环状，超螺旋 松弛环状，非超螺旋
是否与蛋白质结合
不结合
共价结合
对某些核酸酶抗性 强，不容易被降解 弱，容易被降解
分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异