化学发光免疫

第三节 化学发光免疫分析的类型
一、直接化学发光免疫分析
用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相 应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-发光剂标 记抗体复合物，加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂 （吖啶酯）在不需要催化剂的情况下分解、发光 。
萤火虫发光
萤火虫荧光素
荧光素酶 ATP；O2；Mg2+
光 + AMP+ O2 + CO2 +
氧化型荧光素
腰鞭毛虫
水母
深海鱼发光
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化学发光
概念：某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应
过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子 中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时， 以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
连接到被标记物分子的反应基团上.
碳二亚胺（EDC）缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法
间接偶联：用功能交联剂在标记物和被标记物之间插入一 条链或一个基团，使之连接成结合物
琥珀酰亚胺活化法
1. 碳二亚胺（EDC）缩合法
经缩合反应，蛋白质分子中的游离羧基与发光剂中的氨基形成稳定的酰胺键 用于结构中有羧基或氨基的标记物
电化学反应： 三联吡啶钌：标记抗体/抗原 TPA（三丙胺）：电子供体
磁性微粒子固相 亲和素- 生物素间接包被，使检测的灵敏度大大提高。
电化学发光免疫检测系统（Elecsys)
Elecsys1010
Elecsys2010
E170
样本盘型
样本架型
电化学发光免疫分析示意图
ECLIA体系结构图
ECLIA检测流程图一 （双抗体夹心的形成）
由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这 部分光的积分与待测抗原的量成比例，可从标准曲线上计算出待测抗原的 含量。
吖啶酯化学发光的特点
• 标记物：吖啶酯及其衍生物 • 底物： Pre-trigger（双氧水）/trigger（氢氧化钠） •固相载体：顺磁性微粒 • 分离：电磁场
特点 抗原和抗体结合与未结合部分的 易分离
第四节 临床应用
思考题
概念：发光免疫分析技术，发光，化学发光 常用发光剂及发光原理 化学发光免疫分析的原理、特点 化学发光酶免疫分析的原理、特点 电化学发光免疫分析的原理、特点 鲁米诺氧途径免疫分析的原理、特点
感光微球
A B 发光微 球
200nm
LOCI的特点
是均相反应的模式，反应时间更短； 反应过程有放大效应，发光迅速，保证了测定的敏感性； 整个能量（光）的产生、传递和放大过程十分稳定，不易受pH
值、离子强度和温度的影响； 可实现对多种生物分子的测定，包括酶的活性、受体-配体反应、
低亲和力的反应、第二信使水平、DNA、RNA、蛋白质、多肽、 碳水化合物等。
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三、电化学发光免疫分析（ECLIA）
是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三 丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性 化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
电化学发光免疫分析的特点
Biblioteka Baidu
在电极表面因电子转移而发生的特异性化学发光反应， 包括了电化学和化学发光两个部分。
ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）
ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）
ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）
电极表面的电化学发光反应
ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）
四、鲁米诺氧途径免疫分析（LOCI）
均相反应模式 核心原理：高能态离子氧的产生和传递 两个微粒：感光珠：内含酞箐（鲁米诺类化学发光物质）
（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再 返回到基态，并释放光子的过程。
发光的分类
光照发光：指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后， 电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较 长波长的可见光（荧光）。
生物发光：指发生在生物体内的发光现象
化学发光：指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象
2. 过碘酸钠氧化法
用于含有芳香伯胺和脂肪伯胺的发光剂 不适于无糖基的蛋白质
3．重氮盐偶联法
蛋白质中能偶合重氮盐的位置：酪氨酸残基的酚羟基邻位 组氨酸残基的咪唑环 色氨酸残基的吲哚环
4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
影响标记的因素
1．发光剂的选择 2．被标记蛋白质的性质 3．标记方法的选择 4．原料比 5．标记率 6．温度 7．纯化与保存
化学发光酶免疫分析的特点
• 标记物：酶（HRP、ALP) • 底物(发光剂）：HRP--鲁米诺
ALP--AMPPD • 固相载体：磁性微粒、塑料珠、塑料锥形小管 • 分离：磁场、高速离心
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
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A+B→C* C* →C+h.γ
间接化学发光:
A+B→C* C* +D→C+D*
D* →D+h.γ 步骤：化学反应生成中间体；化学能转化为电子激发能使中间 体变成电子激发态；激发态分子辐射光子回复到基态。
化学发光效率
发光剂在反应中的发光分子数/参加反应的分子 数
由发光物质的性质决定
化学发光免疫技术的分类
化学发光与荧光的区别：形成激发态分子的激发能不同
化学发光产生的条件
关键步骤
化学发光 的条件
化学激发 发光
反应必须提供足够的能量（170~300KJ/mol)
(首要条件)
化学能必须能被某种分子吸收而产生电子 激发，且有足够的光量子产率
大多数化学发光反应为氧化-还原反应
化学发光产生的条件
直接化学发光:
2、酞箐、二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物
通过活性离子氧传递连接的间接化学发光剂 核心原理：高能态离子氧的产生和传递
680nm激发光
酞箐结构
离子氧
200nm范围内 二甲基噻吩衍生物
612nm 光
Eu螯合物
激发
紫外光
二、发光剂的标记技术
通过化学反应将发光剂连接到抗体或抗原 直接偶联：通过偶联反应，使标记物分子中反应基团直接
Y
化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法）
化学发光免疫测定仪
ARCHITECT- i2000化学发光微粒子免疫分析
二、化学发光酶免疫分析（CLEIA）
CLEIA是用参与催化某一化学发光反应的酶标记抗原 或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应 后，加入底物(发光剂)，通过酶催化底物发光，由光量子 阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以 放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定 物的浓度。
标记物是否需要分离 是否直接发光 反应模式不同 标记物不同
非均相分离方式
固相分离 过滤分离 珠式分离 顺磁性颗粒分离（首选）
第二节 化学发光剂和标记技术
一、化学发光剂（发光底物）
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子 的形式释放能量的化合物
能作为化学发光剂的条件：
①发光的量子产率高； ②物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配； ③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； ④其化学发光常是氧化反应的结果； ⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
•直接化学发光剂 •间接化学发光剂
直接化学发光剂
1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长 为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
2．三联吡啶钌
三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体 三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生 氧化反应。
发光珠：内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物 反应基础：两种微粒相互接近的化学能量传递 感光微粒在680nm激发光下能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧 在200nm范围之内，发光微粒中的二甲基噻吩衍生物接受高能态离子氧产生
紫外光并激发Eu螯合物，发出612nm的光。
激发光 680 nm
1O2
发射光 612 nm
三联吡啶钌
电化学发光剂反应原理
间接化学发光剂
1、酶促反应发光剂
HRP的发光底物：鲁米诺及其衍生物 ALP的发光底物：AMPPD
酶 标记抗体或抗原
（1）鲁米诺（最早合成） 鲁米诺发光原理
（2） AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
第九章 化学发光免疫 分析技术
温州医科大学检验医学院 陶洪群
发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而 建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标 记免疫分析技术。
特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、 试剂无毒、安全稳定、可自动化。
第一节 概 述
发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态