第五章 细胞融合

当上面主要途径被阻断时可由此途径代替补充，即可在次黄嘌呤核糖核酸转移酶 （HGPRT+）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK+）作用下，利用 H（次黄嘌呤）合成嘌呤核苷酸，利用
T（胸腺嘧啶）来合成胸腺嘧啶核苷酸，进而合成 DNA。 救急（应急）途径 HAT 筛选法
一个亲本细胞株为次黄嘌呤—鸟嘌呤—磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT－） 另一个亲本细胞株为胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK－） 在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的 HAT 选择培养液中，上述亲 本细胞都无法生存，只有融合以后的杂种细胞才能生长，因此可有效地选择出杂种细胞。 杂交瘤筛选过程 亲本 1 （突变型细胞株） 亲本 2 骨髓瘤细胞（或胸腺瘤细胞） （HGPRT－和 TK－） （HGPRT+和 TK+） 加 A 后正常和应急两条途径 均被阻断不能合成 DNA 加 A 后主要（正常）途径被阻断，可走应急途径合成 DNA ，但该细胞在一般培养条件下不能 较长时间存活，只有同瘤细胞融合后才获取无限增殖能力 故只有杂交细胞才能在 HAT 培养基上增殖 （骨髓瘤细胞从免疫脾细胞获取 HGPRT+和 TK+，脾细胞则从骨髓瘤细胞获取无限增殖能力） 免疫脾细胞 （三）植物原生质体的培养与融合 总过程包括： 原生质体的制备 原生质体的培养 原生质体的融合 杂种细胞的筛选 杂种细胞的分化 1 原生质体培养的意义 1）融合产生体细胞杂种 2）分离或引入各种细胞器 3）导入外源基因 4）诱发突变体 5）研究细胞信息传递、能量代谢、物质运输等功能 6）研究细胞壁的合成机理 7）研究膜的功能和细胞膜的相互作用 8）研究核质关系 9）研究疾病与抗性生理 2 原生质体的制备 3 原生质体的培养 1）培养方法 液体培养法 固体平板培养法 双层培养法 4 原生质体的融合
此途径可因加氨基碟呤（A，一种叶酸的抵抗剂）被阻断。
DNA 合成过程中所需的脱氧胸苷酸（dTMP）是由脱氧尿苷酸（dUMP）经甲基化形成。甲 基供体是四氢叶酸，四氢叶酸是由二氢叶酸还原酶还原二氢叶酸而来。
氨基碟呤在分子结构上是二氢叶酸的类似物，可与二氢叶酸竞争二氢叶酸还原酶发生不 可逆结合，从而阻断四氢叶酸的形成，不能提供甲基形成 dUMP，最后阻断 DNA 的合成。 3 杂交瘤筛选原理
量在 200—20000 之间。诱导机制可能是由于带有大量负电荷的 PEG 分子和原生质体表面的负 电荷间在钙离子的作用下形成静电键，促使原生质体间的黏着而结合，导致电荷平衡失调并 重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 2 基本过程及注意事项
（1）亲本原生质体事先做好识别标记（色素、缺陷型、抗性标记等） （2）原生质体密度在 105/ml 左右，比例 1：1 （3）PEG 分子量通常为 4000—6000，浓度 50% （4）加入 PEG 后迅速混匀，置 24℃培育 10—20min，然后缓缓加入高 pH、高钙离子溶 液，15min 后用洗涤液洗涤，离心收集。 （三）物理法——电场诱导细胞融合 电融合是 20 世纪 80 年代发展起来的。优点是融合率高、重复性强、伤害小、方法简便 易行、可在显微镜下观察融合的全过程。 原生质体在短时间内强电场（高压脉冲电场，场强为 kV/cm 量级）作用下，极化产生偶 极子，紧密排开成串珠状，在适当时间和强度（如 50mA、1.2kV/cm)的直流电脉冲作用下， 细胞膜被击穿，进一步形成融合体。 （四）物理法——激光诱导细胞融合 更具高度选择性、有效性 六、融合细胞的选择
膜融合是两个不同的膜相互接触和融合，导致两膜脂和膜蛋白的相互混合及两侧内含物 的混合。细胞融合的基本步骤包括：
1 细胞密切靠近 2 细胞桥形成 3 细胞质渗透 4 细胞核融合 ★ 融合机制种种 1） “脂无序”模型 Lucy，1970-1975 2）Ca2+诱导的侧向“相分离”模型 Papahadjopoulos 1978 3）六角形 HII 构象与膜融合 Cullis and Hope1978 4）Ca2+诱导局部脱水与膜融合 Wilschut and Hoekstra 1984 5）渗透模型与膜融合 Lucy 1986 6）质子泵驱动膜融合 刘树森 1986 膜融合过程大体概括为两大阶段：首先是两膜脂相互聚合和接触，其次是接触部位的局 部脱水，形成不稳定中间结构，使膜脂发生混合而最终导致膜的融合 四、细胞融合的材料
第五章 细胞融合(cell fusion) 一 、细胞融合的概念
用人工方法把同种或不同种的两个或两个以上的细胞，通过介导物作用，融合成一个细 胞的技术。亦称体细胞杂交（somatic hybridization） 二、 细胞融合的意义（应用） 1 进行基因定位，绘制人类基因图 基因定位的方法 家系分析法 细胞融合法 基因剂量效应法 重组 DNA 法 分子杂交法 限制性片段长度多态性技术 脉冲电泳法（PEGE） 基因图：指将人类染色体上所有基因按其具体位置、次序和间隔距离详细地排列而成的图， 又叫染色体连锁图 2 诱导 PC 染色体 3 体细胞杂种的致瘤性分析 4 遗传缺陷的基因互补 5 分化功能表达调控的研究 6 淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 ☆ 植物细胞的原生质体融合培育杂种植株 8 核质相互作用关系 9 基因治疗 10 疾病诊断 三、细胞融合的机理
由于核融合的情况不同，形成不同的杂种植株。 1） 亲和的细胞杂种 具有双亲全套染色体，异源双二倍体。
2） 部分亲和的细胞杂种 一个亲本的染色体有少量重建或重组于另一亲本的染色体组中。
3） 胞质杂种 一亲本的染色体被全部排斥，但胞质是双亲的
4） 异核质杂种 具有一个亲本细胞核和另一个亲本细胞质的类型。 4）利用生长特性选择
6 融合细胞和杂种筛选 1) 利用遗传互补选择 a 叶绿体缺失互补选择 b 营养缺陷型互补选择 c 抗性互补选择 2) 敏感差异选择 3) 利用物理特性选择 1978 年，西德科学家获得蕃茄—马铃薯的杂种植株； 1982 年，美国培育出“土豆西红柿”； 1986 年，日本培育出稻（C3）和稗（C4）之间的新品种，同时“生物白蓝”（38）[白菜（20） +甘蓝（18）]成功； 1988 年，联邦德国培育出地下结马铃薯，地上结西红柿的“马铃柿”。
七、细胞融合技术的应用举例
制备细胞悬液 双亲细胞的选择 诱导细胞融合 杂种细胞筛选 1）由抗药性细胞组成的杂种细胞筛选 2）由营养缺陷变异型细胞组成的杂种的筛选 3）由温度敏感突变型细胞组成的杂种的筛选 杂种细胞的培养 （一）动物细胞融合技术的基本步骤 （二）动物细胞融合举例——单克隆抗体的制备 1 单克隆抗体的制作原理 2 单克隆抗体的制作过程 1） 动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 2）骨髓瘤细胞的获得与培养 3） 细胞融合 4） 抗体的检测及杂交瘤的选择 5） 单抗的大量生产 细胞合成 DNA 有两条途径 主要途径（生物合成）：糖、氨基酸→核苷酸→DNA
近 20 几年来，利用细胞杂交技术培育出众多的杂种植株。 ☆ 动、植物细胞杂种—“牛肉蕃茄” 7 杂种细胞的再鉴定 1）杂种植株和亲本植株的形态学特征比较 2）杂种和亲本的核型分析
3）杂种和亲本的同工酶谱分析 4）分子生物学方法
★ 已得到的细胞杂种 8 细胞杂交的几个重要进展 八、细胞融合技术的进展与展望
1 融合体的类型 在整个融合液中，除了未融合的单亲细胞外，主要包括三种类型的融合细胞。 1）同核体——同源原生质体的融合 2）异核体——非同源原生质体的融合 3）多核体——含有双亲不同比例核物质的融合体
融合体的筛选方法 1）遗传互补筛选法 2）抗性互补筛选法 3）生长特性筛选法 4）物理特性筛选法 5）其他方法
5）水溶性蛋白质和多肽（如牛血清蛋白） 20 世纪 70 年代，华裔加籍科学家高国楠发现 PEG 能促进植物原生质体融合，开辟了 植物细胞融合的研究。 目前化学法主要包括：NaNO3 诱导、高 Ca2+、和 pH 诱导、PEG 诱导、PEG 结合高 Ca2+ 和 pH 诱导等，后者最为常用。
1 基本原理 PEG(polyethylene glycol)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH，平均分子
植物细胞杂交是指将两个原生质体融合成一个细胞的过程，又称体细胞杂交。 Cocking（1971）建议程序的代表图示
起源细胞（降解细胞壁） ↓
亲本原生质体（诱导融合） ↓ 集聚粘连 ↓ 胞质融合（异核体培养） ↓ 核融合、壁再生（杂种细胞选择） ↓ 细胞分裂（杂种愈伤组织) ↓ 诱导分化（器官、胚状体形成） ↓ 杂种植株 5 再生植株的种类
1 植物或微生物原生质体的制备
2 动物单个细胞的获得 酶解消化法（胰蛋白酶、胶原酶）
五、 细胞融合的方法 （一）生物法——病毒诱导细胞融合
仙台病毒（Sendal virus）又称日本血凝性病毒（HVJ），是一种 RNA 病毒，1962 年冈 田善雄发现，能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。
引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分，特别是磷脂成分，而与核酸活性无关。 （二）化学法——PEG 结合高 Ca2+、pH 诱导法 1）高级脂肪酸衍生物 2）脂质体 3）钙离子 4）水溶性高分子化合物—聚乙二醇（PEG） 最为常用
1 不对称融合——将亲本之一遗传物质部分破坏后再同另一完整原生质体融合的方式。 结果形成各种非整倍体。
2 胞质杂种——是一亲本去核后的胞质体与另一亲本完整细胞的融合。 复习思考题 1 什么是细胞融合？诱导细胞融合有几种方法？ 2 试述细胞融合的基本原理。 3 细胞融合技术有哪些应用？