总大肠菌群

总大肠菌群（滤膜法）

1、适用范围

生活饮用水、水源水

2、仪器

高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。

3、步骤

(1)储备培养基的制备

品红亚硫酸钠培养基：

加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5

g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液（50g/L）20mL、蒸馏水1000mL。

配制方法：

先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解（用大烧杯），于另500ml蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000ml，混匀后调pH值为7.2～7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min，储备于冷暗处备用。（建议培养基用多少配多少）

乳糖蛋白胨培养基

蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水

1000ml。

配制方法：

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2-

7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的

试管中，于高压蒸汽灭菌锅中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

(2)平皿培养基的制备

将上面制备好的备用的培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠

置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭

菌。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪

成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基15ml倾入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。

(3)滤膜灭菌

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需要换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。滤器用蒸汽灭菌器103.43kPa（121℃，15lb）高压灭菌20min。

(4)水样过滤

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100ml水样（如水样含菌数多，可减少样量，或加水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门抽滤。

(5)培养

水样抽滤完后，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h。

(6)结果观察

A.挑取符合特征的菌落进行革兰氏染色、镜检：

紫红色、具有金属光泽的菌落；

深红色、不带或略带金属光泽的菌落；

淡红色、中心色较深的菌落。

B.凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基，于37℃培养

24h，有产酸产气者则判定为总大肠菌群阳性。

C.补充知识-革兰氏染色：细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精

脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为

两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方

便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌

则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈

革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。(7)样品测定步骤

按下式计算滤膜上的总大肠菌群数，即：

总大肠菌群数（CFU/100mL）=

式中：m——数出的总大肠菌群数；

V——过滤的水样体积（mL）

V m*100