美兰染色法检测酵母活性的优化试验

美兰染色法检测酵母活性的优化试验

啤酒酵母质量的检测方法主要分为两类：一是检测酵母活性，二是检测酵母活力。酵母活性是指酵母能否成活的能力，而酵母活力是衡量活细胞活动能力或发酵性能的指标。当然酵母活性比酵母活力对酵母状态的判断要弱，只限于鉴别酵母的死活,不能明确地分辨活体酵母细胞的质量，但酵母活性的检测方法比酵母活力的检测相对要简单，检测时间短，在日常的生产检验中应用更强。

美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。

文献中查找美兰染色法时，发现有多种美兰染色液的配制方法。我们选择了三种差异较大配制方法进行比较试验，找出一种染色易于判断，结果准确的酵母活性检测方法。还对美兰染色方法进行优化，分析操作中易引起误差，以提高检测方法的准确性。

1材料与方法

1.1 L1100系列生物显微镜

1.2 试剂及配制方法：

1.2.1方法1 ：FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液：

溶液A：次甲基蓝蒸馏水溶液0.1g/500ml，

溶液B：磷酸二氢钾蒸馏水溶液13.6g/500ml，

溶液C：磷酸氢二钠（12H2O）蒸馏水溶液 2.4g/100ml，

溶液D：498.75ML溶液B+1.25ML溶液C，

溶液E：混合500ML溶液D和500ML溶液A，

配制的次甲基蓝缓冲液PH为4.6。

1.2.2方法2：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%次甲基蓝溶液）：

甲基蓝0.01g，

二水合柠檬酸三钠2g，

用蒸馏水定容至100ml。

1.2.3方法3：吕氏碱性美兰染色液：

次甲基蓝0.3g，

95%乙醇30ml，

0.01%氢氧化钾溶液100ml，

将次甲基蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。

1.3 美兰染色法比较试验

配制不同酵母状态的样品（如：扩培酵母液，发酵液，回收酵母，还可对酵母进行老化处理等）分别用三种美兰染色液对其活性检测。

染色液与酵母样品液等量混合，染色3-5min，用血球计数板计数，细胞总数在(30-60)×106个/ml。每一种方法对同一酵母样品进行检测时，同时由三个人来计数，记录结果，注明细胞染色判断的难易。通过对三个人检测结果分析，染色判断的难易来找出较优的美兰染色法，结果见（表1）。

表1 三种美兰染色法检测酵母活性比较结果

藏红T又叫番红O，是从藏红花柱头中提取的一种天然染色剂，为红橙色粉末，是植物组织学实验中最常用的染色剂之一。

番红可以溶解于水和乙醇，通常配成1%水溶液染植物的木质部，也可以

按照以下配方配成苯胺番红液对组织进行块染：番红5g，95%乙醇50mL，苯胺油20mL，蒸馏水450mL。

番红能够对植物的木质化、栓质化和胶质化部分进行染色，染色后的部分为红色。染色时间一般为2~24hrs，常与固绿等进行合作染色。

番红花提取物有细胞毒性，但对肝、肾、膀胱等器官无任何毒性。