荧光染料探针分子对变异细胞的识别_费学宁

收稿: 2005 年 9 月, 收修改稿: 2005 年 12 月 * 通讯联系人 e-mail: feixuening@ eyou. com
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化学进展
第 18 卷
殖与细胞的生存无关, RNA 的信息借逆转录酶进入 宿主的 DNA 中。伴随着这些变化, 膜上的糖蛋白和 糖脂的糖链缩短, 即出现糖链缺陷现象。肿瘤的发 生常常跟细胞表面的糖蛋白变异有关, 或者是在肿 瘤细胞表面某种天然存在的寡糖过量表达, 或者仅 在细胞发生恶变以后才会产生某种形式的糖。许多 与肿瘤有关的抗原都含有唾液醇单糖, 胃、结肠、胰、 肝、肺、前列腺和乳腺癌等这些与内皮细胞有关的细 胞变异和病毒转移均与唾液醇 单糖的过量表 达有 关, 依靠唾液醇对细胞提供靶向性进行肿瘤诊断是 一种有效方法。这种现象存在为多糖修饰的荧光染 料探针分子对变异细胞的识别提供客观可能性[ 1] 。 1. 2 细胞识别与荧光标记技术
摘 要 介绍了变异细胞的结构特征、细胞识别与荧光标记技术以及荧光染料探针分子标记细胞的方 式。简述了荧光染料探针分子用于变异细胞组织的标记与识别的研究新进展。并针对目前荧光染料探针分 子的应用现状, 分析了未来的发展趋势, 包括增强荧光染料探针分子与人体组织的相容性、靶向性, 提高其灵 敏度, 降低毒性等的方法和途径。简述了固相合成分离技术用于探针分子的制备与纯化的优越性。
第 6期
费学宁等 荧光染料探针分子对变异细胞 的识别
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及光谱性质的变化在于 TOTO 头部基团与单链碱基 之间的堆积作用和链上两个阳离子正电荷与 DNA 骨架上的负电荷之间的库仑力共同作用的结果。
改变多亚甲基链两端的染料分子, 可以得到不 同的 异 二聚 体 TOTAB、TOTIN 等。该 类染 料 还 有 POPO、BOBO 以及不对称单亚甲基菁染料 PO- PRO、 BO-PRO、TO- PRO、YO- PRO 等[8] 。 2. 2 含活性基团的荧光探针 2. 2. 1 直接用于生物分子的标记
Key words fluorescent probe; aberrant cell; recognition; label
1 变异细胞的结构与特征
1. 1 结构与特征 细胞膜上存在某些特定的生物活性分子并由其
形成特定结构或机制, 以保证细胞与外界环境之间 及细胞内各膜系统间能进行物质、能量及信息交流。 在胎儿体细胞的细胞核内已经安排好分化和分裂次 数的遗传学精确调控程序, 而肿瘤细胞就目前所知 是不受这种分裂调控程序限制的。肿瘤是指细胞在 致瘤因素作用下, 基因发生改变, 失去对其生长的正 常调控, 导致异常增生。细胞骨架紊乱, 某些成分减 少, 细胞表面特征改变, 产生肿瘤相关抗体。正常细
按照荧光染料探针分子标记细胞的方式可分为 嵌入式荧光探针和含有活性基团的荧光探针。 2. 1 嵌入式荧光探针
此类荧光染料本身不带有活性基团如羟基、氨 基等, 是以亲和力嵌入核酸等生物分子中的。这类 探针包括单体噻唑橙( TO) 和 唑黄( YO) 系列以及 由它们的单体通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二 聚体的 TOTO 和 YOYO。它们在自由态( 未与核酸结 合) 时不发荧光, 但与核酸结合后荧光显著增强, 染 料与 DNA 结合后, 尤其是与双腺 DNA 结合, 其荧光 强度增大1 000倍以上, 与 RNA 结合时, 荧光强度甚 至增大到3 000倍以上。TO、YO 系列染料及其二聚 体的这种荧光增强特性, 是由于染料在嵌入核酸后 其亚 甲基 两端 两 个杂 环 的空 间 扭转 受 阻 而产 生 的[ 6] 。Carreon 等[ 7] 认为 ssDNA-TOTO 复合物稳定性
假如把正常的体 细胞突变看作形成肿瘤的原 因, 那么用 DNA 的变化就能说明细胞的遗传改变。 直接的致癌物质可使 DNA 直接发生化学变化而引 起细胞 的突 变, 其效 应与致 癌性 成正 比。当 致癌 DNA 病毒嵌入宿主细胞的 DNA 中, 其 DNA 在细胞 内增殖时该细胞常不能生存, 而致癌 RNA 病毒的增
关键词 荧光染料探针分子 变异细胞 识别 标记 中图分类号: Q2; TQ617. 3 文献标识码: A 文章编号: 1005- 281X( 2006) 06- 0801- 07
Recognition of Aberrant Cell Using Fluorescent Probe
Fei Xuening1* Liu Lijuan1 Zhang Baolian1, 2 Shi Bojie1 Yao Kangde2 ( 1. Materials Department of Tianjin Inst itute of Urban Construction, Tianjin 300384, China;
2. Research Institute of Polymeric Materials, T ianjin University, Tianjin 300072, China)
Abstract The structure characteristics of aberrant cell, identification marking, fluorescence labeling technologies and methods of cell labeling by fluorescent probe are recommended. T he progress of research on labeling of aberrant cell t issue by fluorescent probe or by connecting with biologically act ive carrier is reviewed. Based on the applicat ions in cell marking of fluorescent probe, the developing trends are described including approaches and methods of increasing the compatibility of fluorescent probe with bodies tissue, the validity for labeling towards the aberrant cell, improving the sensitivity and reducing toxicity of fluorescent probe. The advantage of preparation and purificat ion of probe using solidphase synthesis technology is prospected.
息改变现象的时空分布。
2 荧光染料标记细胞的主要方式
荧光染料是一种广泛使用的荧光标示剂( 又称 为荧光探针) , 它提供了比传统的同位 素检测更实 用、更安全的 DNA 片段标记方法, 具有检测速度快、 重复性好、用样量少、无辐射且可实现测序的实时、 在线、计算机处理等优点。在 DNA 自动测序、抗体 免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广 泛应用。利用荧 光探针可 测定 RNA 和 DNA; 研究 DNA 碱基损伤 修复; 辨别蛋 白质分 子中 氨基 的状 态, 蛋白质分子的活性区, 检测 pmol 级的蛋白质; 区 分不 同构象的核 酸以及有 关药物的 化学反应 活性[ 4] 。
荧光标记技术是利用荧光物质通过物理或化学 作用与待测组分结合, 使待测组分转化为荧光物质, 再经过荧光检测而获得被测组 分定性或定量 的信 息。随着现代医学、分子生物学的发展和各种先进 荧光检测技术及仪器, 如流式细胞仪( FCM) 、激光扫 描共聚焦显微镜( LSCM) 等的应用, 荧光标记作为一 种非放射性的标记技术受到广泛重视, 并取得迅速 发展。荧光标记技术已用于环境污染物、药物、氨基 酸、手性分子、核苷酸等多种物质的测定[ 2] , 细胞内 外物质检测及疾病早期诊断等。在酶促反应、免疫 反应和蛋白质的生物合成等许多生命化学过程中具 有十分重要的意义[ 3] 。
用生物合成路径将一种生物代谢底物( 色素) 作用到 细胞表面, 从而实现细胞表面的化学改性, 使细胞表 面连接上易于与荧光染料作用的活性基团, 来实现 细胞的识别与标记。例如利用氮化物的叠氮反应将 药物引入细胞表面, 如图 2 所示, 通过异常氨基酸将 叠氮基结合到蛋白质上, 在细胞溶菌液中通过共价 改性来标记蛋白质。这样蛋白质上的叠氮基便可与 新型荧光染料作用。染料与蛋白质作用前均不发荧 光, 当探针与蛋白质作用后发出明显荧光, 通过成像 技术可显示偶氮- 蛋白与细胞的联系[ 9] 。
胞染色体的不正常变化, 会启动细胞凋亡过程, 但是 癌细胞中, 细胞凋亡相关的信号通路产生障碍, 也就 是说癌细胞具有不死性并可无限增殖。且肿瘤细胞 代谢旺盛, 肿 瘤组织的 DNA 和 RNA 聚合酶活性均 高于 正常 组织, 核酸 分 解过 程明 显 降低, DNA 和 RNA 的含量均明显增高。
第 18 卷 第 6 期 2006 年 6 月
化 学 进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol. 18 No. 6 June, 2006
荧光染料探针分子对变异细胞的识别
费学宁1* 刘丽娟1 张宝莲1, 2 石博杰1 姚康德2
( 1. 天津城市建设学院材料系 天津 300384; 2. 天津大学高分子材料研究所 天津 300072)
细胞识别与构成细胞外被的寡糖链密切相关。 寡糖链由质膜糖蛋白和糖脂伸出, 每种细胞寡糖链 的单糖残基具有一定的排列顺序, 编成了细胞表面 的密码, 它是细胞的/ 指纹0, 为细胞识别形成分子基 础。同时细胞表面尚有寡糖的专一受体, 对具有一 定序列的寡糖链具有识别作用, 因此细胞识别实质 上是分子识别。利用荧光标记物进行分子识别是近 年来生命科学领域中的研究热点。荧光标记技术与 激光扫描共聚焦显微技术的联合应用, 可以直接观 测到活细胞中重要生物分子的位置、运动及与其他 分子的相互作用, 观测细胞骨架上的微丝、微管, 观 察信号转导通路上的各种酶与信使分子, 还可以利 用基因重组技术将自身已有荧光的蛋白导入细胞, 用激光扫描共聚焦显微镜研究基因表达、细胞内蛋 白的相互作用及细胞的离子通道等[3] 。荧光检测方 法对细胞异常改变的识别消除了环境的影响因素, 灵敏度高。在室温下, 通过激光引出荧光在单分子 检测和单分子光谱的最新研究为在生理条件下的个 别大分子研究提供了新的工具, 并可以测定生物信
常用于细胞标记的荧光染料探针主要有吖啶、 菲啶类染料, 荧光素类、罗丹明类、噻嗪和 嗪类染 料, BODIPY ( boron dipyrromethene difluoride ) 染料, 二 氟烷硼类、二苯乙烯类、萘酰亚胺类、芴类荧光染料 和菁类染料等。其中菁染料以其光谱范围广、摩尔 消光系数大、无荧光背景、荧光量子产率高、灵敏度 好以及具有与 ds-DNA 的高度亲和力等特征, 正逐步 取代传统的荧光标记染料成为新一代标记染料。菁 染料对肿瘤细胞比对正常细胞更具亲和力[ 5] , 将它 们与抗癌化学药物分子结合, 将在癌细胞的早期标 记中得到广泛的应用。单体 噻唑橙( TO) 和 唑黄 ( YO) 系列及其二聚体染料为其中一种典型的嵌入 式探针, 以其标记速度快、接近生理 pH 条件、对生 物分子的功能活性影响小等优点, 而成为目前研究 比较活跃的一类典型标记菁染料。
大多数荧光染料带有活性基团, 能与生物分子 以化学键合的方式得到标记物, 以这种共价键结合 得到的标记物分子比嵌入方法所得的复合物要稳定 得多。其检测原理是: 通过活性基团如琥珀酰亚胺 ( NHS ester) 、异腈酸酯( NCS) 或邻苯二甲酰亚胺等与 蛋白质 、DNA 、核 酸 或 其 他 生 物 大 分 子中 的 羟 基 、氨 基或巯基以化学键的方式键合, 使染料荧光特性发 生变化, 借此提供大分子结构和性能的信息。荧光 染料分子以键合方式插入蛋白质形成荧光络合物如 图 1 所示。