大学创新大赛饲用大豆及其制品中脲酶活性快速检测管

第十届大学生创新大赛

竞赛作品

作品名称：饲用大豆及其制品中豚酶活性快速检测管学院：生物工程学院

申报者姓名

（集体名称）___________

类别：

□自然科学类学术论文

□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文

□科技制作（投入较大的）

V小发明创造

饲用大豆及其制品中腮酶活性

快速检测管研究报告

摘要：饲用大豆及其制品中含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，动物采食后会出现腹泻、胰腺肿大等症状，导致生产性能下降。胰蛋白酶抑制剂的活性不易测定，但是由于蛋白酶抑制剂是一种蛋白质，对热的敏感性与腺酶相似，且两者共存，因此，本设计通过测定饲用大豆及其制品中麻酶活性来间接反映胰蛋白酶抑制剂的活性。由于麻酶在室温下可将尿素水解生成氨，氨可使酚红指示剂变红且反应时间与腺酶活性具有相关性，因此将尿素缓冲液及酚红指示剂以一定的比例制备反应体系。在比色管反应体系中直接加入待测饲用大豆及其制品，根据反应时间带入拟合方程，计算麻酶活性。应用该检测管可以快速、准确、直观的检测饲用大豆及其制品中腺酶活性，进而对胰蛋白酶活性进行监测，从而判定饲用大豆及其制品的饲用安全性。

关键词：大豆豆粕服酶活性胰蛋白酶抑制剂快速检测管

一、研究背景及意义

饲料工业是现代畜牧业和水产养殖业发展的物质基础，直接关系到农业、农村经济发展和人民生活质量，已经成为国民经济的重要基础产业之一，在促进养殖业健康可持续发展、农民增收方面和改善人民的生活质量等方面发挥了重要的作用。饲料安全问题日趋严重，有效解决饲料安全问题是保证饲料工业可持续发展的关键，也是保证动物源性食品安全的重要措施之一。因此饲料安全检测变得尤为重要，饲料安全的快速检测技术，则为饲料安全的监督和检测提供重要的技术支撑。随着饲料安全问题的相继曝光，由饲料安全问题引发的食品安全问题已经成为民众日常关心的热点和焦点。为此，国家相关部门加大了饲料的监管、监测力度。为了满足饲料安全监督的即时性需要, 迫切需要一些快速、方便、准确的检测技术，尤其是对某种或某类特别物质的快速检测，对提高饲料安全的监督和管理具有重要的作用。

大豆，及其制品是优良的植物性蛋白质饲料，同时含有丰富的矿物质与维生素，是目前世界范围内动物饲料原料中最常用的植物性蛋白饲料。但是，大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消化、吸收和利用的抗营养因子和一些有毒物质，如麻酶、胰蛋白酶抑制剂、植物性红细胞凝集素、皂昔等。当抗营养因子的含量超过动物的耐受范围时会影响到动物的健康和生产性能。大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制剂是影响动物安全食用的重要指标之一，由于其和腺酶都属于水溶性蛋白质，加热处理时都会失去活性，而且失活的速率大致相同，因此他们的活性指

标与水溶性蛋白含量指标(即水溶性氮指数)存在着内在联系。麻酶活性的大小可以定量的反映大豆及其制品在加热时的失活程度，通过测定腺酶活性可以间接预测大豆胰蛋白酶活性，因此快速、准确检测腺酶活性对监测饲用大豆及其制品的食用安全性具有重要意义。

在目前国际上测定腺酶活性的的方法大致有滴定法即国家标准方法(GB/T 8622-2006). pH增值法、酚红法等方法。但是由于滴定法要求精度高，所用试剂品种较多，且配置复杂，测定过程中操作时间过长，操作步骤较严格，给检测人员的批次检测带来不便，难以在生产中快速应用。实际生产中一般多用pH增值法，pH增值法由于测定结果的准确度与与精准度都不是很高，所以不具有仲裁性。本次设计拟对酚红法、国标法两种方法进行研究，设计出一款兼顾时效性和准确性，满足现场要求，设计出大豆及其制品中腺酶活性快速检测管, 该管适应各种各样的需求环境，不需专业的实验室及专用的检测设备即可完成，实现快速、简便、准确的检测大豆及其制品中淼酶活性。

二、技术路线

本研究的设计思路：首先制备不同熟化程度的大豆粉，应用国家标准方法对其进行腺酶活性测定得出结果，同时应用快速检测方法测定反应时间，并与腺酶活性值进行相关性研究，建立拟合方程。对未知样品通过测定反应时间，通过带入建立的拟合方程来计算豚酶活性值。技术路线图见图lo

图1.技术路线图三、实施方案

1 •材料与方法

1.1大豆粉样品制备

取若干生大豆粉，将生大豆粉在120匸烘箱中烘焙，分不同时间取出，制备不同梯度酶活性的豆粉。

釆样：用取样铲在托盘上取不同时间段的豆粉，分别有20 min.

30 m in、40 m in、50mim、60 min、70 min、80 m in、90 in in、100 m in、

110 min. 12 Omin的样品，冷却后将样品放入封口袋，扎紧以防松散，并贴上标签标注放一旁备用。

1.2试剂与溶液

本实验所用试剂均为分析纯（AR）、水为蒸馆水

121尿素缓冲溶液（pH7.0±0.1）：

准确称取8. 95g磷酸氢二钠，3.40g磷酸氢二钾，加蒸馆水溶解定容至1000ml,再将30g尿素溶解在此缓冲溶液中，贴上标签放置一旁备用，有效期一个月。

1.2.2 盐酸溶液（O.lmol/L）:

移液枪调至& 4,准确移取8. 4ml浓盐酸于烧杯中，加蒸馆水稀释至1000ml,贴上标签备用。

1.2.3氢氧化钠标准滴定液（O.lmol/L）：

准确称取4g氢氧化钠溶于水，并稀释定容至1000ml,贴上标签（标签上应写标定后的实际浓度）备用。

1.2.4邻苯二甲酸氢钾(基准试剂):

在100-125°C烘箱中干燥lh,置于干燥器中备用。

1.2.5提取液(尿素酚红溶液)的制备：

称取一定量的邻甲苯酚駄，溶于乙醇(95%),用乙醇(95%)稀释至

100ml备用。称取一定量尿素(H2NC0NH2M99.0%)，溶于蒸馆水中并标定至500ml备用。用胶头滴管吸取适量邻甲酚红溶液滴加至尿素溶液中。在提取液中加入少量药品，将提取液配置在恒温箱中并且记录保存时间、备用。(因提取液的配制过程中含有专利部分不便透露)

1.3实验设备

电热鼓风干燥箱、精准pH计、恒温水浴锅、精密计时器、分析天平、磁力搅拌器、移液枪等。

2.实验步骤

2.1 电位滴定法：(GB/T 8622-2006)

实验原理：将粉碎的大豆样品与中性尿素缓冲溶液混合，在(30 ±0.5)匸下保持30min,样品中的腺酶催化尿素产生氨，用过量的盐酸中

和吸收氨，再用氢氧化钠溶液回滴到溶液的pH值为4. 70

o

准确称取0. 05g上述某一烘焙时间豆粉样品，称准至0. lmg,转入试管中，移入10汕尿素缓冲液，立即盖好试管并剧烈摇动马上置于30±0.

即刻移入10mL盐酸溶液，迅速5°C恒温水浴中，准确计时保持30min

o

冷却到20°Co将试管内容物全部转入烧杯，用5niL水冲洗试管两次，立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4. 70,并记录消耗氢氧化钠溶液的体积£。

另取试管做空白试验，加入10mL尿素缓冲溶液，10mL盐酸溶液。称取与上述完全相同的试样，也称准至0. lmg迅速加入试管中。立即盖好试管并剧烈摇动，将试管置于30±0.5°C恒温水浴中，同样准确保