细菌鉴定流程
细菌的初步鉴定
细菌的初步鉴定一、启动条件：1、目地样：同一取样原因，取表现性状相同的任意1—2包进行细菌初步鉴定。
如表现性状不同的，需分别进行鉴定；不同取样原因，需分别取样进行鉴定。
2、随机样：相同时段出现坏包，取表现性状相同的任意1—2包进行细菌初步鉴定；不同时段出现坏包，需分别进行鉴定。
3、坏包产品的包装无明显破损。
4、由微生物污染引起的坏包：酶类及化学反应用不同的查验方式。
二、样品处理准备1、酸包：检测时发现产品感官及PH值有明显变化时，需快速将酸包产品的内容物移入无菌容器内（移入时需用75%的酒精棉对操作员手及开包产品的移出口进行擦试灭菌），并需快速检测。
如不能检测，需冷藏保存2小时内进行检测。
2、胀包：使用75%酒精棉对样品外表面擦试消毒后放于超净台内待检。
检测时，以无菌操作在无横纵封处剪一半圆或三角取样。
三、检测（划线，接种培养）：低酸产品：检测细菌、芽孢、耐热芽孢，必要时检测霉菌、酵母菌。
高酸产品：检测细菌、霉菌、酵母菌。
1、细菌：采用无菌手续取1ml样品接种于培养皿中，使用普通营养琼脂于36±1℃/48小时条件下培养；另采用无菌操作使用接种环于营养琼脂上作划线培养（37℃/48h）2、芽孢、耐热芽孢：以无菌操作取10ml样品于两个小试管中，分别在80℃和100℃的水浴中加热10min。
冷却后使用营养琼脂培养基的无菌操作，分别作芽孢（36±1℃/72h）和耐热芽子包（55±1℃/72h）的接种与划线培养。
80℃10min—杀灭全部未形成孢子的细菌细胞，孢子可存活。
100℃10min--杀灭部分细菌孢子，耐热孢子可存活。
3、霉菌、酵母菌：采用接种环以无菌手续于专用培养基上作划线培养，另采用1ml吸管以无菌操作，接种1ml样品于专用培养基中培养。
（条件25—28℃/5天）四、记录样品：名称、批号、取样原因、时间、样品感官、PH值、酸度、气体形成、包装密封性、凝块、分离等。
细菌鉴定流程
革兰氏阳性球菌鉴定流程一.做触酶试验:1.阳性者做以下试验:(1)葡萄糖发酵试管(OF管); (2)DNA酶或/和血浆凝固酶;(3)新生霉素敏感试验结果判断:(1)-/O微球菌属;(1) F (2) + 金黄色葡萄球菌;(1) F (2) – (3) S 表皮葡萄球菌;`1``(1) F (2) – (3) R 腐生葡萄球菌;注:-/O 为氧化或不利用; F为发酵; S为敏感; R为耐药2.阴性者做以下试验:(4)奥普托欣药敏试验; (5)胆汁七叶树苷; (6)杆菌肽药敏试验; (7)马尿酸水解试验(8)6.5%NaCl生长试验; (9)乳糖或/和淀粉酶试验; (10)精氨酸;(11)山梨醇和/或丙酮酸盐; (12)溶血环结果判断:(4) + 肺炎链球菌(4) – (5) + (8) – (9) –马链球菌(4) – (5) + (8) – (9) + 牛链球菌(4) – (5) – (12)a 草绿色链球菌(4) – (5) – (12) B (6) + A群链球菌(化脓性链球菌)(4) – (5) – (12) B (6) – (7) +B群链球菌、无乳链球菌（4）-(5)- (12) B (6) –(7) –其它群链球菌→血清凝集→分群革兰氏阴性球菌坚定流程做以下试验:(13) DNA酶（14）TM培养基生长试验（15）ONPG和/或乳糖（16）葡萄糖（17）麦芽糖结果判定：（13）+ 布兰汉氏菌属（13）- （14）-索生奈瑟氏菌（13）-（14）+（15）+ 乳糖发酵奈瑟氏菌（类脑膜炎奈瑟氏菌）（13）-（14）+（15）-（16）+（17）- 淋病奈瑟氏菌（13）-（14）+（15）-（16）+（17）+ 脑膜炎奈瑟氏菌革兰氏阳性杆菌坚定流程先做触酶试验一．阳性者做以下试验（18）芽孢（19）5℃生长(20)抗酸染色结果判断：（20）+ 分枝杆菌（20）－（18）+ 芽孢杆菌属（20）－（19）+ 李斯特菌属（20）－（18）－（19）－棒状杆菌属二．阴性者做以下试验（20）抗酸染色（18）芽孢结果判断：（20）+ 分枝杆菌属（20）－（18）+ 梭菌属（20）－（18）－丹毒丝菌属革兰氏阴性杆菌鉴定流程先做（1）葡萄糖发酵试管（OF）管（21）氧化酶将G-杆菌分为三类结果判断:(1) F (21) –肠杆菌科(1) F (21) + 弧菌科(1)O/- (21) +/- 非发酵菌群弧菌科鉴定流程(22)甘露醇(23) 生长需要Na+结果判断:(22) + (23) + 弧菌属(22) + (23)- 气单胞菌属(22) - (23) + 发光杆菌属(22)- (23) - 邻单胞菌属肠杆菌科做各自的生化鉴定管非发酵菌群以上均为叶燕输入张国伟2004．7．1。
细菌分离培养与鉴定程序
细菌分离培养与鉴定程序一、背景记录1、猪的临床症状2、不同猪的发病阶段（早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡）3、解剖病变（保存好照片）二、分离用培养基1、常用培养基：鲜血琼脂培养基、巧克力培养基2、非常用培养基：麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基三、病料的选取和保存1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽2、得到病料后应该立即进行细菌分离，分离细菌前最长保存时间（在4℃冰箱内）最好不要超过3-4小时。
分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。
分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途（需再次接种、需再次触片、需接种动物等等）可先将病料暂存4℃冰箱，但不得超过2天。
一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存，多余的病料进行无害化处理。
四、分离路线1、选择分离细菌的目标脏器：根据疑似疾病和病理变化确定，一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器，并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。
一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。
并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价，如：心血中的细菌多为全身感染分布的病原；关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。
）2、分离细菌一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌（如：副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等）感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。
划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域，然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。
这样一方面可保证分离到病料中的细菌，另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便，同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。
如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌，二者互为参考。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程一般分为以下几个步骤：
1. 样品收集：根据需要鉴定的细菌类型和来源，选择适当的样品收集方式。
样品可以是细菌培养物、体液、食物等。
2. 培养：将样品接种到适当的培养基上进行培养。
根据细菌的生长条件需求，选择适当的培养基，如富含寡营养物的普通培养基、特殊选择性培养基等。
3. 盱衡生长：根据细菌类型和特性，观察细菌的生长状况，如菌落形状、颜色、大小等。
4. 形态学鉴定：使用显微镜观察细菌的形态学特征，包括细菌的形状（球形、杆状、螺旋形等）、大小、菌落或细胞的结构、芽生等。
5. 生化鉴定：进行一系列生化试验以确定细菌的生化特性，如氧需求、发酵产物、酶反应、代谢产物等。
6. 免疫学鉴定：通过免疫学方法，如血清学试验、酶联免疫吸附试验等，检测细菌对特定抗体的反应性，以确定细菌的免疫学特性。
7. 分子生物学鉴定：应用分子生物学技术，如PCR（聚合酶链反应）、序列分析
等，检测细菌的DNA或RNA序列，以确定细菌的基因特征和亲缘关系。
8. 数据分析和鉴定：根据样品收集、培养、观察、试验等结果，综合分析得到的数据，确定细菌的鉴定结果。
可以参考细菌鉴定手册或数据库，进行对照确认。
这些步骤都需要进行严格的实验操作和分析，以确保细菌鉴定的准确性和可靠性。
不同类型的细菌鉴定流程可能会有所不同，具体流程可以根据实际需要进行调整和优化。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
菌株鉴定流程总结
学习总结各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。
现将我在实验室学习的情况总结汇报。
一、细菌鉴定流程：1.表观观察鉴定：培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。
显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。
染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。
2.分子鉴定：细菌DNA的提取（试剂盒法）⑴将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。
⑵将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。
⑶向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。
如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。
⑷向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
⑸加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑹加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑺将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑻向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑼向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑽重复操作步骤⑼。
⑾ 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm 离心2min ，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
简述细菌种属的分类鉴定流程
简述细菌种属的分类鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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进行细菌种属分类鉴定首先要进行样本采集。
临床微生物实验室细菌鉴定指南汇总
临床微生物实验室细菌鉴定指南(续)温州医学院附属第一医院实验诊断中心潘钦石一．细菌的鉴定步骤1．鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2．对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。
（我们这里一般都是预先纯化培养）3．对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，G–c，G+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。
要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4．按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。
另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。
5．复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。
第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(H2O2实验)：a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。
要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
临床微生物实验室细菌鉴定指南汇总
临床微生物实验室细菌鉴定指南(续)温州医学院附属第一医院实验诊断中心潘钦石一．细菌的鉴定步骤1．鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2．对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。
（我们这里一般都是预先纯化培养）3．对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，G–c，G+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。
要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4．按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。
另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。
5．复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。
第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(H2O2实验)：a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。
要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
细菌感染的实验室检验流程
实验室技术人员
报告生成
根据检验结果生成报告，并通知医生和患者
实验室管理员
结果解读与确认
医生解读报告，确认诊断并制定治疗方案
医生
细菌感染的实验室检验流程
流程步骤
具体任务和目标
负责人员
Hale Waihona Puke 样本采集采集感染部位的样本，如血液、尿液、痰液等
医护人员
样本处理
对采集到的样本进行初步处理，提取目标细菌
实验室技术人员
培养
将样本接种在适当的培养基上，培养细菌至足够数量
实验室技术人员
鉴定
对培养出的细菌进行形态、生理和生化鉴定
实验室技术人员
药敏试验
细菌鉴定流程概述(PPT44页)
关键试验
• 触酶 • OF（氧化发酵）试验 • 血浆凝固酶：玻片法，试管法
链球菌科细菌
• α溶血：肺炎链球菌 • β溶血：化脓性链球菌
B群链球菌 C、G群链球菌 • γ溶血：肠球菌
肺炎链球菌
• 菌落形态 • Optochin试验：注意耐药菌株 • 胆汁溶菌试验
β溶血链球菌鉴定
β溶血链球菌
• 化脓性链球菌 • B群链球菌
• 4h快速试管凝固酶试验阳性 注意：1.试管法应该至少每小时判读一次直至4h.试管法的最后读取应在4h 后. 2.中间葡萄球菌和猪葡萄球菌可在12-24h 试管凝固酶试验为阳性. 3.凝固酶试验仅推荐用无菌乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝兔血浆.
* 商用乳胶凝胶试剂 腐生葡萄球菌在某些情况下可表现为阳性,但其玻片凝固酶及试管凝固酶试验 通常为阴性. 因此,商用凝集试验阳性结果不能用来鉴别尿中的非溶血葡萄球菌
• 血平板上常表现为边缘光滑的窄的"溶血环" • 革兰阳性球菌成对或成链,触酶阴性; • 快速马尿酸盐水解试验阳性或快速CAMP因子
斑点试验阳性均可准确鉴定无乳链球菌 • 商用凝集试验鉴定该菌准确性接近100%
肠球菌
• 触酶试验阴性 • 七叶苷试验阳性 • 6.5%NaCl肉汤生长（高盐+）
肠球菌鉴定-CLSI
血平板上菌落大于1mm,BAP上非溶血且触 酶阴性 革兰染色形态为阳性球菌或球杆菌成对或成 链 PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可鉴定为肠 球菌属. 增加亮氨酸氨肽酶(LAP)试验可更好地鉴定 α溶血肠球菌
革兰阳性细菌鉴定卡GP-VITEK-2
注意事项：
• 细菌的要求：新鲜；纯培养菌落 鉴定一定要有全局的观念
脑膜炎奈瑟氏菌在血平板上形成有光泽、浅灰色菌落，为革兰阴性双球菌，氧化酶和γ-谷氨酰氨肽酶阳性 局限性,极少数气单胞菌属分离菌株可与铜绿假单胞菌形态相似(缺乏典型气味),可通过斑点吲哚试验区分(气单胞菌属阳性,铜绿假单胞 菌阴性). 氧化酶阳性,菌落有典型的气味(康科德葡萄或玉米饼)和形态特征(金属或珍珠般光泽,粗糙,产色,有时极其黏稠). 革兰阳性球菌,成双或成链排列,触酶阴性,PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可确认为化脓链球菌
手工法细菌鉴定简易操作程序
手工法细菌鉴定简易操作程序
SOP_15-14 手工法细菌鉴定简易操作程序
细菌鉴定简易程序(手工法）
说明：
1、该表为简易鉴定，仅为鉴定提供大致方向，有些细菌并未包括进来，表中《规程》为第三版《全国临床检
验操作规程》，所有鉴定该书为准。
2、葡萄球菌属可使用杭州天和公司《葡萄球菌属鉴定编码册》
（TH-16S ）
3、β溶血性链球菌使用链球菌乳胶凝集进行分群
4、肠杆菌科细菌使用杭州天和公司《肠杆菌科鉴定编码册》（15e 或11e ）
5、弧菌科、气单胞、邻单胞使用杭州天和公司《弧菌科细菌鉴定编码册》（GYZ-9V ）
6、非发酵菌杭州天和公司《非发酵菌鉴定编码册》（15n 或11n ）。
生物实验室菌检工作流程
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细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
4. 沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR 扩增。
注意事项：①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。
②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。
（若结果不理想则用改良方法）1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul 0.1-0.5% Triton X-100的200ul PCR管中，充分重悬。
2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%Triton X-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ulPCR管中。
3. 将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。
0.1-0.5% Triton X-100的配置：①30%储备液的配置Triton X-100 1.41ml0.1mol/L PBS(pH=7.3) 3.64ml充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。
②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。
普通PCR体系：（23ul反应体系）50管×PCR体系配制ddH2O 918.5ul10×buffer 125uldNTP 100ulrTaq 6.5ul1.配制体系所用的200μl PCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。
2.配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。
3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合器上混合5~10秒。
4.每23μl分装入200μl PCR管中，放-20˚Ϲ备用。
5.使用体系之前先验证体系是否好用。
例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。
注意事项：（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20˚Ϲ保存。
（2）无菌操作PCR程序：94˚Ϲ 5min94˚Ϲ 30s35个循环 55˚Ϲ30s72 ˚Ϲ 1 min 30s72 ˚Ϲ10 min4 ˚Ϲ 1 minPCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中2.缓冲液的配制：（1）50 ×TAE Buffer储备液Tirs 12.1g 、Na2EDTA.2H2O 1.86g ，加30ml去离子水搅拌溶解，加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。
（2）1×TAE Buffer取10ml 50 ×TAE Buffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。
3.配胶：琼脂糖0.15g缓冲液（1×TAE）15ml加热煮沸3次待温度降低到50˚Ϲ~60˚Ϲ时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。
4.拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。
5.上样：（1）取3ul 标准 DNA Maker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。
（2）取一只塑料手套，将1ul 6×Loading buffer点到手套上（3）取3ul PCR产物与1ul 6×Loading buffer即3:1混匀点入梳孔。
6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNA Maker 比较，即亮度和长度。
7. 如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μl PCR产物放4˚Ϲ保存待测序公司来取样。
8.PCR产物送进行测序。
*注意事项：核酸染液属于致癌物质，配胶以及与胶有关的仪器一定要戴胶皮手套操作测序结果分析：将测序结果掐头去尾后在NCBI（/）网站上进行BLAST比对。
具体操作步骤如下：粘该菌序列可参照相似度95%以上为可信结果。
结合细菌形态学鉴定、革兰氏染色、16S rDNA比对结果初步判定该菌是属于哪个属，进行以下实验。
四、生理生化鉴定选用API相关菌属鉴定试剂盒，具体类型参照以下：（1）API 20 E鉴定革兰氏阴性杆菌（2）API Listeria 鉴定李斯特菌（3）API 20 NE 鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌（4）API 20 C AUX 鉴定酵母菌（5）API 20 A鉴定厌氧菌（6）API Coryne 鉴定棒状杆菌（7）API 50 CHB 鉴定芽孢杆菌（8）API Campy 鉴定弯曲菌（9）API Staph 鉴定葡萄球菌和微球菌（10）API Strep 鉴定链球菌（11）API 50 CHL鉴定乳酸杆菌（12）API NH 鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、布兰汉球菌检测方法：（具体参考说明书）1.试剂条的准备：准备培养盒（盘和盖子），向盘的蜂窝状孔中倒入约5ml蒸馏水或去离子水，创一种潮湿的环境。
将菌株参考号记录在托盘的长条上，从各个包装中取出试剂条，将试剂条放入培养盒中。
2. 接种物的准备：用0.9%的生理盐水将培养板上的菌冲下收集（建议使用早期培养物18~24h），该菌悬液制备好后必须立即使用。
3. 试剂条的接种：将菌悬液接种到微型管中，只填充试管部分，杯型器不填充（微型管留少许不充满）。
将试剂条稍前倾，将吸管或滴管的顶部靠在杯的侧面，以免管的底部形成气泡。
4. 用矿物油填充杯形器，形成凸出弯月面，以保证ADH和URE实验的无氧环境。
5. 在36˚Ϲ下培养18~24h。
五、药敏实验1.将平板上纯化出的菌用2~3ml 0.9%灭菌生理盐水冲下，制成菌悬液。
2.无菌条件下取100μl菌悬液到培养基平板上。
根据培养基的干湿程度适当调整菌悬液的用量。
3.三角玻璃刀蘸酒精后，经过酒精灯高温灭菌，待火灭后温度降低至20˚Ϲ左右，均匀涂布4.将药敏纸片贴到平板上，每个平板上可贴4个药敏纸片，常用水产药物：诺氟沙星（氟哌酸）、头孢曲松（菌必治）、庆大霉素、奥复星（氧氟沙星）、头孢哌酮、强力霉素、四环素、卡那霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、吡哌酸、先锋霉素、氨苄西林、青霉素、利福平、多粘菌素、磺胺甲基异恶唑5.28℃恒温培养24h后测量抑菌圈直径大小。
注意事项：①贴药敏纸片时字朝里②正置培养例如：配制培养基例如：NA固体培养基（1）称取蛋白胨3.3g放入三角锥形瓶中。
（海水培养基加NaCl至终浓度为20‰）（2）蒸馏水定容至100ml，并放入转子，用锡箔纸封口，记号笔标注时间名称。
（3）将三角锥形瓶放在磁力搅拌器上高温搅拌，待液体透明并大量气泡产生时迅速拿下（戴手套，防止烫伤），用吸铁吸出转子。
（4）将三角锥形瓶、装有平板的铁桶放入高压灭菌锅中，121℃灭菌15分钟。
（5）将灭好的培养基及铁桶迅速放到操作台中，紫外通风，待培养基温度不烫手时倒板（在酒精灯旁操作）。
（6）打开平板盖子，紫外线通风约30min，待凝固后盖上盖子，平板放4℃保存。
注意事项：①操作台使用前喷酒精，用无菌棉擦干，紫外通风约30min。
②放入灭菌锅前装有平板的铁桶的排气孔处于打开状态，灭菌完应迅速关闭排气孔后放入操作台中。