不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达

不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达

不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达戴随（天津市第五中心医院检验科，天津300450）摘要：目的探讨不同来源的鼠伤寒沙门菌侵袭力和毒力基因表达的差异。方法从腹泻患者粪便﹑河水及土壤中共分离出鼠伤寒沙门菌（分别简称为临床株﹑水体株﹑土壤株）34株，分析菌株在上皮细胞黏附﹑侵袭以及巨噬细胞内复制能力的差异；选择与黏附﹑侵袭以及复制阶段相关的毒力基因（鞭毛合成位点filC，致病岛1位点hilA﹑invI，致病岛2位点ssrA﹑sseF），通过实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测不同来源细菌的毒力基因表达差异。结果土壤株和水体株的黏附力和侵袭力与标准菌株（ATCC 14028）类似，但80%左右的临床株表现出比标准菌株（ATCC 14028）更高的黏附力和侵袭力。在巨噬细胞内的复制结果显示，临床株﹑土壤株以及水体株的胞内复制能力均与标准菌株（ATCC 14028）类似。不同菌株的毒力基因表达情况与细胞黏附﹑侵袭及胞内复制结果相吻合。高侵袭力临床株在黏附期filC基因以及侵袭期hilA﹑invI基因的表达量显著高于标准菌株（ATCC 14028）（P＜0.05），而胞内复制期ssrA和sseF基因的表达量与标准菌株（ATCC 14028）类似。土壤株和水体株在不同时期的基因表达量均

与标准菌株（ATCC 14028）类似。结论鼠伤寒沙门菌临床株显示出较环境菌株更强的黏附力﹑侵袭力及更多的相应毒

力基因表达量，应着重加强对医院内沙门菌感染的防控措施，降低医源性沙门菌的感染率。关键词：鼠伤寒沙门菌；侵袭力；毒力基因表达鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患致病菌，广泛寄生于人和动物肠道内。其通过粪口途径传播，主要引起肠胃炎，在免疫功能低下的个体如老人和小孩中能引起全身性中毒症状，严重者可致死[1]。鼠伤寒沙门菌的致病过程分为肠道感染和细胞内感染2个阶段：细菌黏附并侵入小肠上皮细胞，为肠道感染阶段；细菌进入上皮细胞或巨噬细胞内，然后在胞内复制，为细胞内感染阶段。其致病能力与多种毒力因子相关，包括致病岛1﹑致病岛2﹑鞭毛﹑菌毛等[2]，其中影响入侵过程的主要毒力因子为致病岛1，影响胞内复制的主要毒力因子为致病岛2[1-2]。致病菌毒力强弱与细菌来源相关[3-4]。目前，针对沙门菌来源与其致病性之间关系的研究报道甚少。本研究以分离自腹泻患者粪便﹑土壤以及河水的共计34株鼠伤寒沙门菌为研究对象，分析菌株在黏附﹑侵袭﹑胞内复制以及毒力基因表达方面

的差异，为进一步研究鼠伤寒沙门菌的致病特性提供新的实验数据，以期为更好地防控沙门菌感染提供新的思路。1 材料和方法 1.1 菌株与细胞系研究对象为分离得到的34株

鼠伤寒沙门菌，其中包括从医院腹泻患者粪便中获得的18

株（简称临床株，L1～L18），从市内海河水中分离的10株（简称水体株，S1～S10），从土壤中分离的6株（简称土壤株，T1～T6）。所有入选菌株均与O∶4单价血清进行抗血清凝集试验从而被重新鉴定。鼠伤寒沙门菌标准菌株（ATCC 14028）购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），由检验科保存。人结肠癌细胞系Caco-2和鼠巨噬细胞系J774A.1购自上海中国科学院细胞库。 1.2 主要试剂用于细胞培养的RPMI-1640培养基﹑胰酶和胎牛血清购自Gibco公司，用于RNA提取的Trizol购自Invitrogen 公司，RNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司，cDNA反转录试剂盒及SYBR Green Mix购自TaKaRa公司，24孔细胞培养板购自Corning公司。 1.3 主要仪器恒温CO2细胞培养箱购自Thermo公司，7500荧光定量PCR仪购自ABI公司，高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，NanoDrop 2000分光光度计购自Thermo公司，凝胶成像系统购自Tanon公司。1.4 方法1.4.1 细胞培养细胞采用RPMI-1640培养基，补充10%的胎牛血清，于37 ℃恒温培养箱中传代培养。当培养瓶中细胞生长到80%以上时，用胰酶消化，之后将细胞均分于24孔细胞培养板内继续孵育约24 h，待细胞铺满各培养孔后直接用于后续试验。 1.4.2 黏附力及侵袭力检测细菌对上皮细胞的黏附力及侵袭力检测参照ISBERG等[5]报道

的方法进行。收集对数中期的细菌，用RPMI-1640培养基重

悬，采用平板计数方法计算初始菌量。细菌按照感染复数（细菌∶细胞）为10加入至细胞培养板中，以1 000×g离心5 min，在37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中共培养1 h。吸去菌液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，加入0.1% 十二磺基硫酸钠裂解细胞，在裂解液梯度稀释后涂板并计数。细菌黏附率=黏附细菌数/每孔中加入的细菌数×100%。侵袭力检测方法基本同上。细菌与细胞共培养1 h，吸去菌液并用PBS洗3次，然后在含细菌和细胞的24孔板中加入含有50 μg/mL庆大霉素的培养基，继续培养1 h，以便杀死未进入细胞的细菌。裂解细胞，稀释后涂平板并计数。细菌侵袭率=细胞内细菌数/黏附细菌总数×100%。

1.4.3 复制能力检测菌株在巨噬细胞内的复制能力检测参

照SITTKA等[6]报道的方法进行。收集对数中期的细菌，用RPMI-1640培养基重悬，按照感染复数为10加入至细胞培养板中，以1 000×g离心5 min，在37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中共培养30 min。用PBS洗3次以便洗掉未被吞噬的细菌，此时的时间点为T0。在含细菌和细胞的24孔板中加入含有50 μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基，于37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中继续孵育1 h，裂解部分细胞，涂板并计数细菌，此时（T1）的细菌数目为初始胞内菌量。将培养基换成新的含10 μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基，继续孵育23 h，裂解剩余细胞，涂板并计数此时（T24）的胞