植物基因克隆的方法共31页文档
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
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1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
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3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物基因克隆实验指导讲义
植物基因克隆实验指导目录植物基因克隆实验规则 (2)实验一：试剂的配制.................. 错误！未定义书签。
实验二：植物总DNA的快速少量提取和浓度检测错误！未定义书签。
实验三：微卫星简单重复序列锚定PCR扩增技术（SSR-PCR） 8实验四：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测错误！未定义书签。
实验五：SSR标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析错误！未定义书签。
实验六：琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物.. 错误！未定义书签。
实验七：PCR产物的T/A克隆及重组子的筛选错误！未定义书签。
实验八：重组子的鉴定................ 错误！未定义书签。
实验论文例文........................ 错误！未定义书签。
植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。
整套实验围绕水稻根系发育突变体的基因克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。
我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。
该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。
二、实验的进行程序和要求1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
基因工程 植物基因的克隆与转化_1_植物基因克隆的方法简介
科技知识讲座植物基因的克隆与转化(1)植物基因克隆的方法简介李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223)生物技术是世界新技术革命的主要内容之一。
它是以生物科学为基础,利用生物体(或是生物组织、细胞及其组分如酶)的特征和功能,用分子生物学的手段,改造生物特性、培育新品种甚至设计构建具有预期性状的新物种,与工程原理相结合进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。
它包括医药生物技术、农业生物技术、海洋生物技术和环境生物技术等领域。
作为生物技术领域的先导技术 基因工程近年来发展迅猛,农业上的转基因动植物研究和开发取得了一系列的突破性进展,对于解决人类面临的资源短缺、环境污染、效益衰减等问题显示出巨大的作用。
随着生物技术产业化进程的加快,正逐渐形成一批新兴的生物技术产业。
它将成为世界经济新的增长点,对于21世纪农业生产乃至人类社会生产、生活的各个方面产生全面而深刻的影响。
基因工程育种不仅能够把各种来源的基因转化到农作物中,还可以重绘许多作物的遗传蓝图,并改变代谢途径或方向。
基因工程育种的前提和条件是必需克隆大量可供利用的功能基因。
基因的克隆就是利用DNA体外重组技术,将特定的基因从染色体上分离出来,插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整序列,确定该基因在染色体上的位置,进一步研究该基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
由于植物的基因组非常巨大,在遗传背景不很清楚的情况下,要从庞大的基因群体中分离出目的基因不是一件容易的事。
近年来,由于生物化学、酶学、分子遗传等学科的迅速发展,为基因的分离奠定了良好的基础,并提供了有效的手段。
在农业生物技术领域,人们利用以前掌握的大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,已经从植物、动物、微生物中克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、育性、淀粉、蛋白质、脂肪及与植物生长发育有关的许多基因。
植物基因克隆的方法
植 物 基 因 克 隆 的 方 法
王 丽媛 ， 徐 明怡 ， 倪 红伟 ，
张 玉， 冷 海 南
（ 黑龙 江省科 学 院 自然与 生态研究 所 湿地与 生态保育 国家地 方联合 工程 实验室 ， 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ４ ０ ）
摘要： 基 因 克 隆技 术 是 挖 掘 新 基 因 、 分 离控 制 植 物 重 要 性 状 基
植物基因克隆的方法
阳性克些候选基因，再进行别离，时空表达
特点，同源性比较等分析确定目的基因。
1. 序列克隆 利用目标基因的近等基因系或别离群体分组分析法〔BSA〕进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
4、目的区域的精细作图 的标记和通过转座子在染色体上
植物基因克隆的方法
基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序 列。
基因克隆：利用体外重组技术，将特定 基因
体中。
和其它DNA顺序插入到载
克隆目标：识别、别离特异基因并获得 基因
的完整全序列，确定染色
植物基因克隆的方法
能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
抑制性扣除杂交〔suppression subtractive
人工合成并克隆基因
方法：根据的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并
克 隆该基因。〔可对基因进行改造〕
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人பைடு நூலகம் 合
成并克隆了此肽的基因。
表 型 克 隆〔phonetypical cloning〕
方法：利用植物的表型差异或组织器官特 异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法 试图把表型与基因结构或基因表达联系起 来，从而别离特定表型相关基因。不必事 先知道基因的生化功能或图谱定位，根据 基因的表达效应就直接别离该基因。
3、构建目的基因区域跨叠克隆〔contig〕
测所测序列或氨基酸序列与序列是否同 定位克隆的优点和局限性
通过转座子上的标记基因〔如抗药性等〕就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
源→发 不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接别离
方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法seek； pursue； go/search/hanker after； crave； court； woo； go/run after植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中.基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系.通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因.我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究舒群芳等,1995;舒群芳等,1997,为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展.1 功能克隆functional Cloning功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆Collis,1995.其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,1将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,2将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆.功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略.Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因Vst1和Vst2,葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢Botrytis cinerce的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义Hain等,1985.Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析Kondo 等,1989.周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA周兆斓等,1996.植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡.胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒Cucumber Mosaic virusCMV,并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因胡天华等,1989.王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒potato virus X, pvx,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯王春香等,1991.病毒外壳蛋白Coat protein cp基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性Coat Protein Mediated Resistance CPMR或病毒CP-RNA介导的抗性.Van kan 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9,可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物Van Kan等,1991.我们1995年构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础舒群芳等,1995;舒群芳等,1997.功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的.如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质.因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质.只要有一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的.采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不知道.所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆.随着分子生物学技术的发展,一条新的基因克隆策略逐渐形成,这就是定位克隆.2 定位克隆Positional cloning根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制,这样一种策略叫定位克隆Monaco,1994.连锁分析即通过基因与DNA标记之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离,即有连锁在一起的趋势.根据这一原理可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位.由于连锁分析需要依赖特定的基因作为连锁标记,即标记基因与待研基因之间存在连锁关系,而满足与待研基因相连锁的基因实在太少,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难.RFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难.1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性RFLP restriction fragment length polymorphism,使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能.限制酶切片段长度多态性是用限制性内切酶切割后产生的DNA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传,是存在于全基因组的独特的多态标记,RFLP使基因定位变得易行Wyman 等,1980.目前定位克隆一般是用RFLP等分子标记制作遗传图谱,寻找与待测基因连锁的RFLP标记,获得基因在染色体上的定位然后克隆基因.所以RFLP和后来发展起来的RAPD技术的建立,可将待测基因相对准确地定位,利用已知的基因可分离与之连锁的未知基因.其基本程序是构建一个基因组文库、用已知的A基因为探针,从基因组文库中筛选出与其有同源序列的a克隆,再用a克隆为探针从基因组文库中筛选出与a克隆有同源序列的b克隆,然后以此类推最后筛选出未知基因并把它分离出来.目前已在番茄、烟草、大麦、水稻、大豆、玉米等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记并构建了遗传图谱Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith,1991;Diers等,1992.用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因Martin等,1993;Bent等,1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995 .Martin等1993年最早用定位克隆技术克隆出番茄pto基因,pto基因负责对带有无毒基因Avrpto的细菌,丁香假单胞菌pseudomonas syringae pv菌株的抗性,Pto基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗性Martin等,1993.Wenyuan等1995年用这一技术克隆了水稻Xa21基因,Xa21基因对真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae Xoo具有抗性Wenyuan 等,1995. 3 转座子标记法transposon tagging 转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段.在转座过程中原来位置的DNA片段转座子并未消失,发生转移的只是转座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因.通过转座子上的标记基因如抗药性等就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来.转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因Fedoroff等,1984;Jones等,1994. 利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:1 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体.2 把转座子导入目标植物.3 利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中,这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的.4 转座子插入突变的鉴定及其分离Ellis等,1992.通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac. Mu, Smp和Ds等.Ac含有编码转座酶的基因,能够自主的转座,Ds不含转座酶所以不能自主的转座,但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就可以自主的转座了.用转座子标记法进行植物基因的分离,首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中,目前多数是利用土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中Keller等,1993;Bancroft等,1993.目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因Johal和Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995.Johal和Brigge分离出抗灰色长蠕孢Helminth osporium carbonum1号小种玉米的HMI特异真菌抗性基因.该基因存在于玉米的抗性品种中,能够分解长蠕孢1号小种产生的对玉米具特异致病性的HC毒素,该基因编码HC毒素脱毒酶可使植物具有抗病性Johal和Briggs,1992.和转座子标记法的原理相似的还有T-DNA标记法,两者都是由于一段基因的插入导致染色体结构发生变化产生突变体,而T-DNA标记法产生的突变是由于T-DNA插入导致的.Kenneth等利用T-DNA插入标记培育出拟南芥矮化突变体Kenneth等,1989. 4 人工合成并克隆基因蜘蛛毒素是一种小肽,它只有37个氨基酸,体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫,蒋红等1995年根据蜘蛛毒素的氨基酸序列,采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆了此肽的基因蒋红等,1995.Adang 1995年人工合成了苏云金杆菌毒蛋白Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein基因Adang等,1995. 5 表型克隆phenotype cloning 1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念Jonsson和Weissman,1995,有些植物目前即不了解它的基因产物,也没有对它们进行基因定位,但已知植物在表型上存在差异,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆.San等用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因Sun等,1992.表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来,从而分离特定表型相关基因,力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位,根据基因的表达效应就直接分离该基因Brown,1994.6 mRNA差异显示mRNA differential display1993年Liang和Averboukh等科学家提出了mRNA差异显示mRNA DD, mRNA differential display的方案Liang等,1993.这一方案的依据是在高等真核生物中所有的生命过程和病理变化,不论是由单基因控制的还是由多基因控制的,最终都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来.研究基因表达差异,研究两基因组差异表达基因的分离,为克隆复杂性状相关基因开辟了重要的途径.该方案可以检测、分离出全长任何部分有突变的mRNA,其基本程序是:1提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA.2 以一定的引物作随机聚合酶链反应.3 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带.4将差异DNA做成探针.5 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析Baeur等,1993.Liang和Pardee又建立了mRNA差别显示PCR方法Liang和Pardee,1992,该方法可以同时分析几个样品间基因的表达,检测灵敏度高,PCR扩增后,一些表达量很低的mRNA也能被检测出来,应用PCR及DNA测序,两种技术简单易行,目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因Joshi等,1996和水稻蔗糖调节基因Tseng等,1995等.7 减法杂交Subtractive hybridizationLee等1991年提出减法杂交技术Lee等,1991,植物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段,由于基因特异性的表达,其mRNA表现不同,这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA,反转录为cDNA,从无特异基因表达的组织中提取mRNA,两者杂交,在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子,而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态,把这种单链cDNA 分离出来即为差异表达的基因,Chong等用此技术克隆了小麦春化相关基因Chong等,1994.8 PCR扩增克隆这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法.目前已经知道了很多植物基因的序列,当克隆类似基因时可先从Gene bank库中找到有关基因序列,用PCR方法克隆不同植物的基因.基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取DNA进行PCR扩增,扩增的片段纯化后连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析检测重组子,并与已知基因序列进行比较,如目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因,根据Masumura等1989发表的10KD水稻醇溶蛋白基因序列合成一对引物,王广立等克隆了水稻10KD醇溶蛋白基因王广立等,1994.9 依据序列同源性克隆基因生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列.此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下,构建cDNA文库或基因组文库,然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆.马德钦等根据文献报道的甜菜碱醛脱氢酶BADH基因的序列作了菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析马德钦等,1996.综上所述,可见发现和克隆基因的过程是艰巨和富有收获的,几十年来各国科学家在基因克隆这一最激动人心的生物高技术领域内走过了艰难而又曲折的历程,从而创造和发展了上述种种植物基因克隆的方法,使人类在认识自然、掌握自然的道路上又前进了一步.前辈所创造的成就和技术无疑为我们成功地克隆植物基因提供了快捷和高效的途径.利用已知序列克隆基因,用同种或同属的已知的同源序列筛选基因都比较容易,适合于克隆那些研究较晚的许多重要农作物的基因.获得极纯的蛋白质是功能克隆的关键,随着蛋白质纯化技术的提高,功能克隆将发挥它的潜在作用.随着植物遗传图谱上基因定位基础研究工作的提高,定位克隆将发挥其巨大的作用. 作者单位：舒群芳李文彬孙勇如中国科学院遗传研究所北京100101赵路首都师范大学化学系北京100037。
植物基因克隆实验总结
2015-2016第二学期生物科学实验（植物基因克隆）实验总结班级：13级生物科学2班学号：1312022005 姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法：实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
实验方法及过程：1. CTAB法提取水稻基因组DNA配制CTAB溶液：(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）2. 配置琼脂糖缓冲液：10×TBE Buffer配制方法：每组需要：称量下列试剂，置于1 L烧杯中Tris：108 gNa2EDTA·2H2O：7.44 g硼酸：55 g向烧杯中加入约800 ml的无菌水，充分搅拌溶解。
加无菌水将溶液定容至1 L后，室温保存。
用时稀释。
3. 开发设计引物LOC_Os02g42310Chromosome 2: 25,442,875-25,450,093OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa JaponicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa IndicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa JaponicaGCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAA TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOryza sativa IndicaGCGCCGGAGACGAAGA-----------------A TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOLIGO start len tm gc%any3'seqLEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTC RIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTTLength：201 japonica, 193 Indica4. PCR反应体系10×扩增缓冲液：每管：2 ul 共需：24uldNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6ul模板DNA ：每管3 ul，共需36ulTaq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul引物1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。
植物基因的图位克隆
参考内容
植物基因分离是现代植物生物学的重要研究领域，对于理解植物生长发育、抗 逆性、品质等方面具有重要意义。图位克隆技术是一种高效的植物基因分离方 法，本次演示将详细介绍图位克隆技术的原理、实验流程及应用实例。
一、图位克隆技术的原理
图位克隆技术是一种基于基因组图谱的基因分离方法。首先，通过物理作图或 遗传作图将目标基因定位到染色体上的具体位置，构建基因组图谱。然后，利 用图谱将目标基因周围的DNA片段分离出来，进行测序和分析。最后，通过生 物信息学方法和遗传学实验确定目标基因的具体序列和功能。
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植物基因的图位克隆
目录
01 引言
03 一、植物基因图位克 隆的技术原理和应用
02 主体部分 04 二、植物基因图位克
隆的实验流程和操作
目录
05 三、植物基因图位克 隆的挑战和解决方案
07 参考内容
06 结论
关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案
引言
随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域 的重要课题。图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因 的研究中发挥重要作用。本次演示将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、 应用及面临的挑战和解决方案。
植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：
1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植 物组织样本。
2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征 或生理特性相关的候选基因。
3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象 信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。
5、功能研究：进一步研究候选基因的功能和作用机制，如通过细胞实验、模 式动物研究等手段。
植物基因克隆的方法共31页文档
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
植物基因克隆的方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
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16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END植物基因ຫໍສະໝຸດ 隆的方法36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。