His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦0

His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）

GE Healthcare产品专家：查业、朱燕

His标签的纯化方式是最常用的亲和层析的方法之一，镍离子作为纯化His融合蛋白的首选金属离子，镍填料的具体使用方法也成为用户比较关心的问题。继His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦第一期収表后，应用户的需求，我们现推出第二

期，内容如下：

1. 使用几次以后发现镍柱的载量下降，挂柱效率降低，如何处理？HisTrap或Ni填料怎么进行有效的再

生或清洗？

答：

如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致。

建议可以采用不同的清洗方法来提高载量：

1）较温和的清洗方法

为了去除沉淀或变性物质，可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤；为去除疏水结合的物质，可以尝试2倍柱体积1%的Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤。若改变不明显，可以选择下面更强烈的清洗方法。

2) 更强烈的清洗方法

首先用5－10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4）洗涤，迚行脱镍操作，然后用5－10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5－10倍柱体积的双蒸水冲洗；

随后迚行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5 M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1－2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤；

最后迚行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在20%乙醇溶液即可。

2. 通过组氨酸标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

答：

可能原因1），蛋白酶部分降解目的蛋白，可通过加入蛋白酶抑制剂改进；可能原因2），杂蛋白对金属离子有高亲和力，可用分步洗脱或咪唑浓度线性梯度洗脱来确定在结合和洗涤过程中最优的咪唑浓度。在样品中加入和平衡液相同浓度的咪唑。可能原因3),杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除。更详细的信息，也可同时参考第I期内容。

另外推荐使用我公司的新产品HisTrap Talon，可获得更高纯度的纯化产物。

3. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

答：

出现这样的情况，主要是缓冲液中DTT的影响， DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与。

对于我公司的普通镍填料，尽管在3mMDTT时颜色会収生变化，但此浓度对填料性能没有任何影响，因此，若您的样品中含有DTT，在上样之前, 我们推荐采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；当不使用时，勿将 Ni Sepharose 6 Fast Flow保存于含还原性试剂的缓冲液中。空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）1）5倍柱体积的双蒸水洗柱；2）5倍柱体积的平衡液洗柱；3）5倍柱体积的洗脱液洗柱；4）10倍柱体积的平衡液平衡。

另外我公司新推出的镍填料Excel系列（Ni Sepharose™ excel，HisTrap™ excel 和His Mag Sepharose excel）可以耐受5mMDTT，10mM EDTA，1M NaOH，相信对还原剂有依赖性的样品来说，是非常好的选择；且该新填料支持大规模分泌型上清样品的上样，同时镍离子的螯合不会受到影响。

4. 填料是否可以重复使用？可以使用多少次?

答：

如果维护的好的话,填料在其效期之内可以一直重复使用。

如果每次都是同样的蛋白迚行纯化没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过5-7次纯化之后可以迚行脱镍和再生镍的再生操作。

如果柱子反压高了，填料需要做彻底的在位清洗CIP，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，然后再重新挂镍，清洗后保存在20％的乙醇中。

5. 我的HiTrap柱子堵了，该如何处理?

答：

柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要离心，或者用 0.22/0.45um的滤膜过滤。由于E.Coli裂解液比较难过滤，客户一般只用 10000g的转速迚行离心，然后直接上柱，这样对填料损害较大，很容易堵柱子。当然我公司的产品HisTrap Crude系列预装柱，迎合了该类客户的需求，可以将初处理的裂解液直接上样，减少了操作时间。对于更大规模的样品，可以考虑中空纤维滤柱0.1-0.2um孔径迚行澄清，否则柱子会因为经常堵塞而报废。

如果柱子不幸堵了，请及时做在位清洗，若不成功，你必须更换填料或者柱子，并在下次上样时优化样品的处理方法。对于预装柱或者是填料，请做好日常的清洗和维护，具体参考说明书，若柱子反压增高了，请彻底做在位清洗CIP。