芍药苷的体外代谢性质_谭妍
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pH 7. 4） ，内含大鼠或人肝微粒体（ 蛋白含量 0. 5 g / L） 和芍药苷（ 终浓度 5 μmol / L） ，37℃ 预孵育 5 min 后加入 同 法 预 孵 育 的 NADPH 溶 液 （ 10 mmol / L） 20 μl启动反应并继续在 37℃ 孵育，0、5、10、15、20、 30 和 60 min 取样，立即加入 200 μl 预冷的、含 50 μg / L 甲苯磺丁脲（ 内标） 的甲醇 / 乙腈（ 1∶ 1） 溶液终 止反应，涡旋，13 000 × g 离心，取上清进样检测芍 药苷的剩余含量。实验平行设置灭活肝微粒体组的 空白对照组、不加 NADPH 的阴性对照组和加入普 萘洛尔的阳性对照组。每组平行 3 个样品。 1. 6 芍药苷在大鼠肝细胞代谢消除检测
［Key words］ paeoniflorin； cytochrome P450； liver microsomes； hepatocytes； metabolism
芍药苷是毛茛科常用中药芍药的主要有效成 分，属于双环单萜类糖苷化合物，具有活血化瘀和解
痉解痛的功效［1-2］。近年的研究表明，芍药苷 还 具 有扩张血管、降血糖、抗肿瘤、免疫调节以及神经保
基金项目： 国家自然科学基金重点课题（ 81130067） ； 国家“重大新药创制”科技重大专项（ 2012ZX09301003-001） 作者简介： 谭 妍，硕士研究生，研究方向： 药物代谢，Tel： 010-66874610，E-mail： tyfairy@ 163． com 作者单位： 100850 北京，军事医学科学院 1． 毒物药物研究所（ 谭 妍，沈国林，庄笑梅，原 梅，李 桦） ； 2． 放射与辐射医学研究所（ 高 月） 通讯作者： 李 桦，博士，研究员，博士生导师，研究方向： 药物毒物代谢，Tel： 010-66930664，E-mail： amms_hli@ 126． com
美国 Agilent 6410B 三重四级杆串联质谱，配备 Agilent 1290 超 高 压 液 相 色 谱 （ UHPLC） 和 Agilent Zorbax C18 色谱柱（ 2. 1mm × 50mm，3. 5μm） 。 1. 3 实验动物
清洁级雄性 SD 大鼠，体质量 200 ～ 240 g，由军 事医学科 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供，动 物 许 可 证 号 SCXK（ 军） 2007-004。 1. 4 大鼠原代肝细胞的分离和培养
方法 将芍药苷与人、大鼠肝微粒体或大鼠肝细胞在 37℃ 孵育，应用液相色谱-串联质谱（ LC-MS / MS） 法测定孵育液中的芍药
苷含量，考察芍药苷的代谢稳定性。将芍药苷与重组人源细胞色素 P450 酶（ CYP） 中 CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和
3A4 孵育，并在人肝微粒体中将芍药苷与各同工酶的特异性抑制剂共孵育，确定其代谢酶表型。结果 在人和大鼠肝微粒体
1 材料与方法 1. 1 药品与试剂
芍药苷（ 批号： 110736-201035） ，中国药品生物 制品检定研究院； CYP 同工酶特异性底物非那西丁 （ CYP1A2 ） 、安 非 他 酮 （ CYP2B6 ） 、甲 苯 磺 丁 脲 （ CYP2C9） 、S-美 芬 妥 因 （ CYP2C19 ） 和 右 美 沙 芬 （ CYP2D6） ，美国 Sigma 公司； 咪达唑仑（ CYP3A4） ， 中国药品生物制品检定研究院； CYP 同工酶特异性 抑制剂 α-萘黄酮（ CYP1A2） 、吉非贝齐（ CYP2C8） 、 磺胺苯吡唑（ CYP2C9） 和反苯环丙胺 （ CYP2C19 ） ， 美国 Sigma 公司； 奎尼丁（ CYP2D6） ，美国 Sigma 公 司； 酮康唑（ CYP3A4） ，中国生物制品检定研究院； NADPH，瑞 士 Ｒoche 公 司 产 品。混 合 人 肝 微 粒 体 （ 蛋白含量 20 g / L，批号 34689） 、重组人源 CYP 同 工酶（ CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和 3A4） ， 美国 BD Gentest 公 司。7-羟 基 香 豆 素、锥 虫 蓝、 UDPGA、Brij 58、D-葡萄糖二酸-1，4-内酯，美国Sigma 公司。胎牛血清和肝细胞培养液，美国 Gibco 公司。 色谱纯甲醇和乙腈，美国 Fisher 公司。 大 鼠 肝 微 粒 体（ 蛋白含量 20 g / L） 和大鼠肝细胞为实验室 自制。 1. 2 仪器
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国际药学研究杂志 2013 年 10 月 第 40 卷 第 5 期 J Int Pharm Ｒes，Vol． 40，No． 5，October，2013
护等作用［3-4］。芍药苷是四物汤、当归芍药散、柴胡 桂枝固体制剂、逍遥丸等中药方剂或制剂中的主要 活性成分 之 一，其 体 内 药 代 动 力 学 已 有 较 多 的 研 究［5-7］，但芍药 苷 的 体 外 代 谢 及 参 与 代 谢 的 酶 尚 未 见报道。本文应用肝微粒体、肝细胞和重组人源细 胞色素 P450（ CYP） 同工酶，研究了芍药苷的体外Ⅰ 相和Ⅱ相代谢消除，并确定参与其代谢的酶表型，为 深入探讨芍药苷体外代谢机制及临床合理用药提供 科学依据。
参照文献［8-9］，采用两步灌 流 法 分 离 获 得 大 鼠 肝原代细胞。分离获得的肝原代细胞以锥虫蓝染色 检测细胞活力，将肝细胞密度调整为 1 × 106 / ml，悬 于含 10% 血清的完全培养基中，制备成肝细胞悬浮 液。
1. 5 芍药苷在肝微粒体中的Ⅰ相代谢稳定性检测 孵育体系为 200 μl K2 HPO4 缓冲液（ 5 mmol / L，
TAN Yan1 ，SHEN Guo-lin1 ，ZHUANG Xiao-mei1 ，YUAN Mei1 ，LI Hua1 ，GAO Yue2
（ 1． Institute of Pharmacology and Toxicology； 2． Institute of Ｒadiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
中，芍药苷均发生依赖于 NADPH 的Ⅰ相代谢消除，60 min 的代谢率分别为 10． 74% 和 22. 76% ，半衰期 T1/2 分别为（ 88. 87 ± 5. 32） 和（ 48. 47 ± 1. 18） min，经外推得到的肝脏清除率分别为（ 13. 13 ± 1. 11） 和（ 10. 06 ± 1. 34） ml / （ min·kg） 。在加入葡萄糖
［Abstract］ Objective To investigate the metabolic characteristics of paeoniflorin in liver microsomes and primary cultured hepatocytes in vitro，and to identify the metabolic phenotyping of phase Ⅰ metabolism． Methods Paeoniflorin was incubated at 37℃ with human and rat liver microsomes in the presence or absence of NADPH or UDGPA，and also incubated with rat primary cultured hepatocytes． The concentrations of paeoniflorin in the above incubation systems were determined by a LC-MS / MS method to evaluate the metabolic stability of paeoniflorin． The cytochrome P450（ CYP） phenotyping of paeoniflorin was identified using a panel of rCYP isoforms （ CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 and 3A4） and specific inhibitors of CYP isoforms in human liver microsomal incubation system． Ｒesults In human and rat liver microsomes，paeoniflorin could be metabolically eliminated in the presence of NADPH． The metabolic rates in 60 min were 10. 74% and 22. 76% and the T1/2 of paeoniflorin was （ 88. 87 ± 5. 32） min and （ 48. 47 ± 1. 18） min for human and rat，respectively． The extrapolated hepatic clearance was （ 13. 13 ± 1. 11） and （ 10. 06 ± 1. 34） ml / （ min·kg） ． In the presence of UDPGA，the cosubstrate of UDP glucuronosyltransferase，paeoniflorin was not metabolized in the human liver microsomes． In the rat primary cultured hepatocytes，paeoniflorin showed a comparable metabolic profile as in the rat liver microsomes with the T1/2 of （ 77. 88 ± 3. 93） min． The results of CYP phenotyping indicated that CYP2C8，2C9 and 3A4 were involved in the metabolism of paeoniflorin． Their individual contributions were assessed using the method of the total normalized rate to be 22. 06% ，52. 47% 和 25. 47% ，respectively． Conclusion Paeoniflorin is mainly metabolized by a number of CYP isoenzymes in liver microsomes and hepatocytes． CYP2C9，3A4 and 2C8 are the major metabolic enzymes responsible for the metabolism of paeoniflorin．
国际药学研究杂志 2013 年 10 月 第 40 卷 第 5 期 J Int Pharm Ｒes，Vol． 40，No． 5，October，2013
·625·
芍药苷的体外代谢性质
谭 妍1 ，沈国林1 ，庄笑梅1 ，原 梅1 ，李 桦1 ，高 月2
［摘要］ 目的 研究芍药苷在人和大鼠肝微粒体，以及大鼠原代肝细胞中的代谢特征，确定芍药苷的Ⅰ相代谢酶表型。
CYP 酶介导的Ⅰ相代谢，主要的代谢表型是 CYP2C9、CYP3A4 和 CYP2C8。
Βιβλιοθήκη Baidu
［关键词］ 芍药苷； 细胞色素 P450 酶； 肝微粒体； 肝细胞； 代谢
［中图分类号］ Ｒ969. 1
［文献标志码］ A
［文章编号］ 1674-0440（ 2013） 05-0625-06
Metabolic characteristics of paeoniflorin in vitro
醛酸转移酶辅酶（ UDPGA） 的人肝微粒体中，芍药苷不发生代谢转化。在大鼠原代肝细胞中，芍药苷的代谢转化率与肝微粒体
相当，T1/2 为（ 77. 88 ± 3. 93） min。芍药苷是由多个 CYP 同工酶介导代谢的，CYP2C9、CYP3A4 和 CYP2C8 是主要的代谢酶，用 整体归一化法评价其代谢贡献率分别为 22. 06% 、52. 47% 和 25. 47% 。结论 芍药苷在肝微粒体和肝细胞中主要发生多个
［Key words］ paeoniflorin； cytochrome P450； liver microsomes； hepatocytes； metabolism
芍药苷是毛茛科常用中药芍药的主要有效成 分，属于双环单萜类糖苷化合物，具有活血化瘀和解
痉解痛的功效［1-2］。近年的研究表明，芍药苷 还 具 有扩张血管、降血糖、抗肿瘤、免疫调节以及神经保
基金项目： 国家自然科学基金重点课题（ 81130067） ； 国家“重大新药创制”科技重大专项（ 2012ZX09301003-001） 作者简介： 谭 妍，硕士研究生，研究方向： 药物代谢，Tel： 010-66874610，E-mail： tyfairy@ 163． com 作者单位： 100850 北京，军事医学科学院 1． 毒物药物研究所（ 谭 妍，沈国林，庄笑梅，原 梅，李 桦） ； 2． 放射与辐射医学研究所（ 高 月） 通讯作者： 李 桦，博士，研究员，博士生导师，研究方向： 药物毒物代谢，Tel： 010-66930664，E-mail： amms_hli@ 126． com
美国 Agilent 6410B 三重四级杆串联质谱，配备 Agilent 1290 超 高 压 液 相 色 谱 （ UHPLC） 和 Agilent Zorbax C18 色谱柱（ 2. 1mm × 50mm，3. 5μm） 。 1. 3 实验动物
清洁级雄性 SD 大鼠，体质量 200 ～ 240 g，由军 事医学科 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供，动 物 许 可 证 号 SCXK（ 军） 2007-004。 1. 4 大鼠原代肝细胞的分离和培养
方法 将芍药苷与人、大鼠肝微粒体或大鼠肝细胞在 37℃ 孵育，应用液相色谱-串联质谱（ LC-MS / MS） 法测定孵育液中的芍药
苷含量，考察芍药苷的代谢稳定性。将芍药苷与重组人源细胞色素 P450 酶（ CYP） 中 CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和
3A4 孵育，并在人肝微粒体中将芍药苷与各同工酶的特异性抑制剂共孵育，确定其代谢酶表型。结果 在人和大鼠肝微粒体
1 材料与方法 1. 1 药品与试剂
芍药苷（ 批号： 110736-201035） ，中国药品生物 制品检定研究院； CYP 同工酶特异性底物非那西丁 （ CYP1A2 ） 、安 非 他 酮 （ CYP2B6 ） 、甲 苯 磺 丁 脲 （ CYP2C9） 、S-美 芬 妥 因 （ CYP2C19 ） 和 右 美 沙 芬 （ CYP2D6） ，美国 Sigma 公司； 咪达唑仑（ CYP3A4） ， 中国药品生物制品检定研究院； CYP 同工酶特异性 抑制剂 α-萘黄酮（ CYP1A2） 、吉非贝齐（ CYP2C8） 、 磺胺苯吡唑（ CYP2C9） 和反苯环丙胺 （ CYP2C19 ） ， 美国 Sigma 公司； 奎尼丁（ CYP2D6） ，美国 Sigma 公 司； 酮康唑（ CYP3A4） ，中国生物制品检定研究院； NADPH，瑞 士 Ｒoche 公 司 产 品。混 合 人 肝 微 粒 体 （ 蛋白含量 20 g / L，批号 34689） 、重组人源 CYP 同 工酶（ CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和 3A4） ， 美国 BD Gentest 公 司。7-羟 基 香 豆 素、锥 虫 蓝、 UDPGA、Brij 58、D-葡萄糖二酸-1，4-内酯，美国Sigma 公司。胎牛血清和肝细胞培养液，美国 Gibco 公司。 色谱纯甲醇和乙腈，美国 Fisher 公司。 大 鼠 肝 微 粒 体（ 蛋白含量 20 g / L） 和大鼠肝细胞为实验室 自制。 1. 2 仪器
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国际药学研究杂志 2013 年 10 月 第 40 卷 第 5 期 J Int Pharm Ｒes，Vol． 40，No． 5，October，2013
护等作用［3-4］。芍药苷是四物汤、当归芍药散、柴胡 桂枝固体制剂、逍遥丸等中药方剂或制剂中的主要 活性成分 之 一，其 体 内 药 代 动 力 学 已 有 较 多 的 研 究［5-7］，但芍药 苷 的 体 外 代 谢 及 参 与 代 谢 的 酶 尚 未 见报道。本文应用肝微粒体、肝细胞和重组人源细 胞色素 P450（ CYP） 同工酶，研究了芍药苷的体外Ⅰ 相和Ⅱ相代谢消除，并确定参与其代谢的酶表型，为 深入探讨芍药苷体外代谢机制及临床合理用药提供 科学依据。
参照文献［8-9］，采用两步灌 流 法 分 离 获 得 大 鼠 肝原代细胞。分离获得的肝原代细胞以锥虫蓝染色 检测细胞活力，将肝细胞密度调整为 1 × 106 / ml，悬 于含 10% 血清的完全培养基中，制备成肝细胞悬浮 液。
1. 5 芍药苷在肝微粒体中的Ⅰ相代谢稳定性检测 孵育体系为 200 μl K2 HPO4 缓冲液（ 5 mmol / L，
TAN Yan1 ，SHEN Guo-lin1 ，ZHUANG Xiao-mei1 ，YUAN Mei1 ，LI Hua1 ，GAO Yue2
（ 1． Institute of Pharmacology and Toxicology； 2． Institute of Ｒadiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
中，芍药苷均发生依赖于 NADPH 的Ⅰ相代谢消除，60 min 的代谢率分别为 10． 74% 和 22. 76% ，半衰期 T1/2 分别为（ 88. 87 ± 5. 32） 和（ 48. 47 ± 1. 18） min，经外推得到的肝脏清除率分别为（ 13. 13 ± 1. 11） 和（ 10. 06 ± 1. 34） ml / （ min·kg） 。在加入葡萄糖
［Abstract］ Objective To investigate the metabolic characteristics of paeoniflorin in liver microsomes and primary cultured hepatocytes in vitro，and to identify the metabolic phenotyping of phase Ⅰ metabolism． Methods Paeoniflorin was incubated at 37℃ with human and rat liver microsomes in the presence or absence of NADPH or UDGPA，and also incubated with rat primary cultured hepatocytes． The concentrations of paeoniflorin in the above incubation systems were determined by a LC-MS / MS method to evaluate the metabolic stability of paeoniflorin． The cytochrome P450（ CYP） phenotyping of paeoniflorin was identified using a panel of rCYP isoforms （ CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 and 3A4） and specific inhibitors of CYP isoforms in human liver microsomal incubation system． Ｒesults In human and rat liver microsomes，paeoniflorin could be metabolically eliminated in the presence of NADPH． The metabolic rates in 60 min were 10. 74% and 22. 76% and the T1/2 of paeoniflorin was （ 88. 87 ± 5. 32） min and （ 48. 47 ± 1. 18） min for human and rat，respectively． The extrapolated hepatic clearance was （ 13. 13 ± 1. 11） and （ 10. 06 ± 1. 34） ml / （ min·kg） ． In the presence of UDPGA，the cosubstrate of UDP glucuronosyltransferase，paeoniflorin was not metabolized in the human liver microsomes． In the rat primary cultured hepatocytes，paeoniflorin showed a comparable metabolic profile as in the rat liver microsomes with the T1/2 of （ 77. 88 ± 3. 93） min． The results of CYP phenotyping indicated that CYP2C8，2C9 and 3A4 were involved in the metabolism of paeoniflorin． Their individual contributions were assessed using the method of the total normalized rate to be 22. 06% ，52. 47% 和 25. 47% ，respectively． Conclusion Paeoniflorin is mainly metabolized by a number of CYP isoenzymes in liver microsomes and hepatocytes． CYP2C9，3A4 and 2C8 are the major metabolic enzymes responsible for the metabolism of paeoniflorin．
国际药学研究杂志 2013 年 10 月 第 40 卷 第 5 期 J Int Pharm Ｒes，Vol． 40，No． 5，October，2013
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芍药苷的体外代谢性质
谭 妍1 ，沈国林1 ，庄笑梅1 ，原 梅1 ，李 桦1 ，高 月2
［摘要］ 目的 研究芍药苷在人和大鼠肝微粒体，以及大鼠原代肝细胞中的代谢特征，确定芍药苷的Ⅰ相代谢酶表型。
CYP 酶介导的Ⅰ相代谢，主要的代谢表型是 CYP2C9、CYP3A4 和 CYP2C8。
Βιβλιοθήκη Baidu
［关键词］ 芍药苷； 细胞色素 P450 酶； 肝微粒体； 肝细胞； 代谢
［中图分类号］ Ｒ969. 1
［文献标志码］ A
［文章编号］ 1674-0440（ 2013） 05-0625-06
Metabolic characteristics of paeoniflorin in vitro
醛酸转移酶辅酶（ UDPGA） 的人肝微粒体中，芍药苷不发生代谢转化。在大鼠原代肝细胞中，芍药苷的代谢转化率与肝微粒体
相当，T1/2 为（ 77. 88 ± 3. 93） min。芍药苷是由多个 CYP 同工酶介导代谢的，CYP2C9、CYP3A4 和 CYP2C8 是主要的代谢酶，用 整体归一化法评价其代谢贡献率分别为 22. 06% 、52. 47% 和 25. 47% 。结论 芍药苷在肝微粒体和肝细胞中主要发生多个