病毒灭活血浆的制备---赵洪飞
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有机溶剂/清洁剂处理血浆时应用上述 TNBP/Triton-100 方法病毒灭活效果较应用于 凝血因子病毒灭活的有机溶剂 / 清洁剂组合的 病毒杀灭效果更好,主要表现在杀灭模型病毒 VSV和Sindbis病毒更迅速。
用有机溶剂/清洁剂法处理血浆的优点之 一是对血浆中蛋白质及、,特别是凝血因子 的损伤小,处理后凝血因子回收率高。另外, 由于处理的是大批量混合血浆,较容易对处 理过程进行质量控制,保证病毒灭活的规范 化和有效性,而且分装的血浆质量均一。但 是,混合血浆处理和单袋血浆病毒灭活(如 亚甲蓝/光照法处理血浆)比较也有不利的一 面。尽管经过献血者的选择和严格的筛选检 测,但是还存在一定的漏检危险。
亚甲蓝/光照法对血浆中凝血因子有一定 的损伤,纤维蛋白原受损最明显,处理后约 损失20%,其他凝血因子回收率较高。 由于作病毒灭活时的浓度仅1 μ m,远低 于临床用量,和半致死量的差距更大,因此 处理后的制品是安全的,不会因为含亚甲蓝 产生毒性。在早期临床应用中,处理后的制 品不去除加入的亚甲蓝而直接应用。几年来 考虑到亚甲蓝使血浆呈蓝色,容易使患者产 生不必要的担心,同时有报道称经光照的亚 甲蓝可能使细胞出现低分化,因此最好在病 毒灭活后去除亚甲蓝。
(二)、有机溶剂/清洁剂法
有机溶剂 / 清洁剂法首先成功的应用于血浆白蛋 白制品的病毒灭活。在此基础上,此技术已延伸并 成功的用于血浆的病毒灭活。血浆融化混合后加入 1% 的有机溶剂 N- 丁基三磷酸盐 (TNBP) 和 1% 的清洁 剂TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚) )<是一种非离 子型表面活性剂(或称去污剂) >, 搅拌混匀于 30℃孵育4小时,出去加入的有机溶剂和清洁剂后除 菌过滤并分装到塑料袋中再次冰冻保存备用。
补骨脂/长波紫外线(UVA)
长波在外线(UVA)照射事先加入补骨脂 类化合物的细胞制品进行病毒灭活处理这一技 术已进行了广泛的研究并已成功地应用于血小 板的病毒灭活。补骨脂在UVA照射时和病毒核 酸的胞嘧啶作用形成环状加合物(单加合物和 双加合物),从而使核酸不能复制、转录,达 到病毒灭活的效果。由于这种处理主要针对核 酸起作用,而血小板为无核细胞,细胞内并不 含核酸,因此可以在杀灭病毒的同时对血小板 无明显损伤,基本维持血小板的活力和功能。
(三)、巴斯德消毒法
法国已经研究开发出用60℃10小时加热处理液态血 浆进行病毒灭活的方法。原则是将新鲜冰冻血浆融 化混合后,加入保护剂。一般选用低分子量糖,如 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等,氨基酸,如甘氨酸等, 目的是在加热处理时减少对血浆蛋白,特别是凝血 因子的破坏,同时对病毒无保护作用,因此,不会 显著影响加热灭活病毒的作用。加入保护剂后边搅 拌边加热, 60℃10小时,加热后用超滤等方法除去 加入血浆中的保护剂,使血浆基本恢复原体积,然 后除菌分装热压封口后冰冻低温保存备用。
主要原因是医生对血浆输注适应症和血浆输注的 病毒危险认识还不够充分,另外,血浆的输注价格较 白蛋白低。由于我国血浆输注量较大,而血浆输注传 播病毒的危险也较大,因此,应用适合于血浆的病毒 灭活方法处理用于临床输注的血浆,对于提高输血的 病毒安全性有重要意义。 血浆病毒灭活的研究已经取得了长足的进步, 现在已应用的或正在研究中的方法主要有:有机溶剂 /清洁剂法,亚甲蓝/荧光照射法,巴氏液态加热法和 补骨脂/紫外线照射法。下面我们将逐一了解一下常 用的这几种病毒灭活的方法:
七、 输注血浆的适应症 1、单个凝血因子缺乏; 2、肝病患者获得性凝血功能障碍; 3、大量输血引起的凝血功能障碍; 4、口服抗凝剂过量引起的出血; 5、抗凝血酶(AT)缺乏; 6、血栓性血小板减少性紫癜(TTP); 7、血浆置换; 8、大面积烧伤; 9、DIC病人。
已开发出用于过滤吸附去除亚甲蓝的滤 器,亚甲蓝/光照处理的血浆经过滤后残存的 亚甲蓝量已低于一般测定方法的可检出量, 血浆恢复原来的的外观和色泽。 亚甲蓝/光照血浆已在欧洲用于临床, 在美国也正在进行临床研究。我国上海市血 液中心已完成实验室研究,并进入临床研究, 相关器材已获得国家药监局的批准。亚甲蓝/ 光照处理的血浆用于临床必将提高我国输血 安全性水平作出贡献。
病毒灭活血浆的制备
输血科
赵洪飞
主要内容
一、血液组成 二、血浆与血清的区别 三、血浆的分类 四、血浆的规格及制备 五、血浆的病毒灭活意义、原因及要求 六、血浆病毒灭活的制备方法 七、 输注血浆的适应症 八、输注血浆的禁忌症
一、血液的组成
简单地说,血液主要由血浆和血细胞(就是人 们所说的血球)两大部分组成,将血液用抗凝剂抗凝 处理后,放在离心机内离心或静置一段时间后就可发 现血浆和血细胞明显分为两部分,血细胞因为分量较 重被沉淀在底部,悬浮在红色血细胞上面的黄色透明 液体就是血浆。 血细胞部分是由有固定形态的红细胞、白细胞 和血小板三部分组成的。
血浆中含有91%~92%的水分,其他的主要成分 是血浆蛋白、激素、营养物质、代谢产物、酶类、电 解质、微量元素和血液气体等。 如果血液不经过抗凝处理,让其自然凝固,血液 也会分成两大部分,沉淀在下面的是凝固在一起的红 细胞、白细胞和血小板三种有形成分;浮在上面的清 晰透明的淡黄色液体是血清,血清中不含有血细胞和 纤维蛋白原成分。
(四)、紫外线(UVA)/光敏物病毒灭活血浆 最近研究发展的单袋血浆病毒灭活方法是 紫外线(UVA)照射,在照射前血浆中已加入补 骨酯类化合物S-59.这种方法最早应用于血小板 的病毒灭活,现转用于血浆病毒灭活,其作用原 理和杀病毒机制亦相似。已证明应用这种方法处 理能取得满意的病毒灭活效果,并且处理对血浆 蛋白特别是凝血因子的损伤在可以接受的范围内。 在美国进行了经处理的血浆和未处理血浆(对照) 临床试验的比较研究。结果证明紫外线/S-59处 理血浆在凝血因子的治疗作用方面和未处理血浆 类似,无明显差别。
血浆再经第二次强离心,上清血浆分入第三 袋中,立即速冻后即为新鲜冰冻血浆。 。 血液成分单采机采集血浆:绝大多数的 血液成分单采机都可以采集血浆。所采集的 血浆在国外可分为原料血浆和临床使用血浆 两种,我国目前只用于原料血浆的采集。 采集过程的操作规程,一定要按不同厂 家的不同型号的血细胞分离机的使用说明来 制定并严格执行。
四、血浆的规格及制备 规格:
目前国内血浆计量单位为ml,常用的规格 为200ml/袋、 100ml/袋和50ml/袋,允许容量 误差范围为±10%。
制备: 手工制备方法:可用二联袋、三联带或 四联袋来制备。 。 用二联袋制备时,制备血液成分用的全血, 就难过一次强离心后即可将浓缩红细胞和血 浆分离,把血浆挤入空卫星袋,迅速冷冻即 成。 用三联采血袋制备悬浮红细胞和新鲜冰冻血 浆时,制备成分用的全血,经第一次强离心 将血浆分入第二袋,再将第三袋的红细胞保 存液加入首袋与红细胞混合即为悬浮红细胞。
(一)、亚甲蓝/光照法
亚甲蓝又称美蓝,为暗绿色并带铜样光泽的结 晶性粉末。临床应用于一些疾病的治疗,半致死量 40~125mg/kg体重。 早在20世纪30年代人们就发现亚甲蓝加上光照 可以灭活病毒,近年来对亚甲蓝/光照病毒灭活方法 做了广泛深入的研究,证明1μ m的浓度下,加上荧光 灯照射,可以杀灭大多数脂质包膜病毒,包括HIV、 HCV、HBV,但是对非脂质包膜病毒如HAV、B19杀 灭效果不理想。近来发现用低压钠灯代替荧光灯进行 照射能提高病毒灭活的效果,而对血浆蛋白影响较小。
另外还有些病毒我们还不知道或还没有进行 常规检测。当混合许多单位血浆一起做处理时, 其中只要有一袋或几袋血袋为病毒污染尚未阳 性血浆时,即会导致整个混合血浆的病毒污染, 只是病毒滴度由于稀释而有所下降。如果由于 某种原因或偶然的操作失误而导致病毒灭活不 彻底,就会使所有处理后的血浆均成为病毒污 染的血浆,严重影响输血患者的安全。因此必 须严格操作规范化和质量管理,做到万无一失。
五、血浆的百度文库毒灭活意义、原因及要 求
1、血浆病毒灭活的定义 血浆病毒灭活指的是,通过物理或化学 手段使病毒蛋白的结构受到破坏,让血 浆中可能存在的病毒失去感染、致病和 繁殖能力。
2、血浆病毒灭活的意义
输血可以传播疾病,特别是各种病毒性肝炎、艾滋病等病 毒,广泛存在血浆里,通过应用血液制品而传播的疾病更是令 人担忧,特别是目前艾滋病的迅速蔓延和全球性的传播,很多 国家把预防和控制HIV感染作为国家生死存亡的一项重大国策。 因此,如何防止因输血而被传染上疾病,是当前输血医学和临 床医学乃至社会各界共同关注的问题。因此,要从根本上控制 和杜绝血源性的传染病,除了加强对一系列血液传播疾病的筛 选外,还必须对血液进行灭活病毒处理,才能做到输血安全。 对血液成分进行病毒灭活是实现安全输血的最直接有效的途径, 这样大大减少病毒感染的几率,为我国的输血及临床事业做出 了重大共享。为防止输血而传播疾病,临床应用病毒灭活血液 制品对防止经血液传播疾病意义是深渊而重大的。
这是长波紫外线/补骨脂法能用于血小 板病毒灭活的理论基础。红细胞也不含细胞 核,但是实验证明当有红细胞存在时将使病 毒灭活效果降低,因此长波紫外线/补骨脂 方法不能用于红细胞制品的病毒灭活,在用 于处理血小板制品时也要按标准控制血小板 制品的红细胞污染量,以免因过多红细胞的 存在而影响血小板病毒灭活的效果。 血浆病毒灭活的紫外线(UVA)照射 法与此方法的原理相似。
二、血浆和血清区别
血清是血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体,其中主要是 白蛋白和球蛋白,血清不会凝固。 血浆是血液的液体部分,呈半透明,淡黄色粘稠状.在 体外可用各种方法使与血液中的细胞成分相分离。 血浆含有血清和纤维蛋白原,后者对凝血有一定作用。 在某种病变情况下,可单独输入血浆,以补充患者的体液。 在凝血过程中,纤维蛋白原转变成纤维蛋白块,所以血
清中无纤维蛋白原,这一点是与血浆最大的区别。
三、血浆的分类
血浆制品主要有新鲜冰冻血浆和普通冰冻血浆。 新鲜冰冻血浆是抗凝全血干6-8小时之内在4℃条件下离 心将血浆分出,并迅速在-30℃以下冰冻成块,即为新鲜冰冻 血浆。冰冻状态一直持续到使用之前,有效期为1年。制品内 含有全部凝血因子,主要用于各种凝血因子缺乏症病人的补 充治疗。 普通冰冻血浆是全血在保存期内或过期5天以内经自然沉 降或离心分出的血浆,立即放人-30℃冰箱冰冻成块,即为普 通冰冻血浆。冰冻状态一直持续到使用之前,有效期为5年。 该制品内含有全都稳定的凝血因子,但缺乏不稳定的凝血因 子VIII和V,主要用于凝血因子VIII和V以外的因子缺乏症病人 的治疗。新鲜冰冻血浆保存期满1年,可改为普通冰冻血浆。
4、血浆病毒灭活的基本要求 (1)病毒的灭活和去除; (2)保持血浆中有效成分的活性和存活力。
六、血浆病毒灭活的制备方法
血浆输注在临床中占有重要的地位,主要用于治疗 各种凝血因子缺乏/活性降低引起的凝血功能障碍,补 充凝血因子。在发达国家一般从全血中分离的血浆 10%-20%直接应用于临床输注,其余大部作为原料制备 血浆蛋白制品。为什么应该强调避免血浆滥用,即不 应将血浆用作血容量扩充剂使用,因为血浆在各血液 成分中是传播病毒危险较大的血液成分之一。因此, 当患者需要提高胶体渗透压维持和扩充血容量时应选 用经病毒灭活处理、安全的白蛋白制品。在我国,还 较广泛的存在血浆滥用现象,大部分从全血分离出的 血浆直接在临床输注。
3、血浆病毒灭活的主要原因: (1)窗口期血液漏检; (2)试剂灵敏度的限制; (3)人为差错; (4)有些已知的可经输血传播的病毒尚未进行 常规筛选检测,例如小病毒B19、巨细胞病毒、 HTLV(人类嗜T细胞病毒)、朊病毒等; (5)目前还有我们尚不知道的可经输血传播的 病毒
由于上述原因,尽管输血传播病毒性疾病的 危险性已经大幅度降低,但是仍存在受血者感染 病毒的危害。因此,除进一步提高血液检测的水 平外,有必要研究和应用病毒去除/灭活技术和方 法处理将用于临床输注的血液和血液制品,去除 和杀灭其中可能存在的病毒,以进一步提高输血 的安全性。