疟原虫的镜检技术

材料： 1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml
注意事项： 1.高纯度试剂。 2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内 遇到美蓝或天青即可互相化合而产生 沉淀，从而失去染色力）。 3.边加边磨，充分研磨；整个染色液பைடு நூலகம் 制时间不能少于5个小时。
姬氏染液的染色方法
先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血 红蛋白，然后再进行染色。
染液的种类及染色原理
注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液 的pH值7.0-7.2较好。
染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使 红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞 浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细 胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。
姬氏染液母液配置方法
检疟原虫血片总计如下
• 千佛山医院
164
• 齐鲁花园医院
94
• 历下三院
112
• 安康医院
94
• 市立一院
146
• 历下医院
144
• 省中医
156
• 二钢医院
45
• 武警医院
137
• 齐鲁医院
120
• 中心医院
19
主要内容
• 疟疾的危害和主要防治经历 • 疟疾快速诊断试剂盒简介。 • 厚薄血膜的制作与染色。 • 疟原虫人体内生活史简介。 • 厚薄血膜疟原虫形态结构特点。
取血方法有小技巧
血膜的制作
用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将 血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂 成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血 膜分载玻片涂制。
发热病人血片
标本片
血膜的制作（涂片操作）
• 涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张 载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴 标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在 第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂 厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人， 涂2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；
疟疾的危害
• 疟疾是古老的地方性传染病：在4,000年前我国已有 疟疾流行。
• 疟疾流行于热带、亚热带及温带边缘地区，是重要 蚊媒传染病，现有107个国家，约32亿人口受到疟疾 传播的威胁，尤其是非洲最为厉害，
• 建国前后我国每年至少有3,000万疟疾患者，病死率 约为1％。
• 山东省年发病人数60年代初和70年代初曾分别高达 600万和400万；鲁南、鲁西南的许多县(市、区）发 病率达40%—50%，一些村队发病率高达80%以上。
）
操作2 (慢染)配制3%染液：在染色量筒内量2ml蒸 馏水或新鲜凉开水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀 ，滴入待染标本上，染色30~40min。清水细缓 冲洗，晾干镜检。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果稳定。
）
影响染色效果的因素
（1）染剂、溶剂的质量 （2）染液的新旧 （3）染液稀释后使用时间 （4）染液的稀释浓度 （5）染色时间 （6）染色用水 （7）冲洗方法
2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜 中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。
3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类 时参考和血片编号之用。
4.镜检疟原虫须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现 疑难问题时再调换10X目镜进行观察。
5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自 左至右，顺序地查完整个血膜。
注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色 效果.
成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸， 倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97 毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当 地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将 染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干 ，包装，镜检。
标签
标本片
发热病人血片
薄血膜的制作
• 薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分①取约1 ～1.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血 滴与平置的载玻片接触，并形成25～350夹角，待 血液向两侧扩展约② 2cm～2.5cm宽时，均匀而迅 速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制 时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角 大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。 制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞 之间互相接触而不相互重叠。③薄血膜外观：舌状
一般情况下，厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较多 ，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血膜检查 时间最少不低于20分钟。
• 看完血片后，若为阳性，应立即按血 片编号登记原虫的种、期，以防差错。为 检查后记录结果方便起见，对疟原虫的种 、期可使用英文字母缩写作为代号：
疟疾的实验室诊断
1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确 诊最可靠。
2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测 （2）循环抗体的 检测
3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟
疾的“金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。
★ 快速诊断试纸条可与镜检 疟原虫相互补充。
取姬氏粉0.5克置于研钵中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或 100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液 混入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀 ，置于55—60℃水浴中或温箱内24h或室温内3—5天，多加摇动，即 成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦 可经久不变。
疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、 疟原虫和白细胞核被染成紫红色。
红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带 正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有 色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色 。疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质 ，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电 荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细 胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染 料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。
厚薄均匀，无划痕，④位于玻片1/2～1/3处【左 半部分（或第4—6份）】 。
熟练工作者的推片姿势
厚血膜的制作
• 厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取① 约4～5微升血量（相当于火柴头大小），使 血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方 向旋转，转2～4圈，涂成②直径0.8～1cm大 小圆形厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野 内可见到5～10个白细胞为宜)，③厚血膜的位 置，位于玻片右1/3处。④厚血膜外观：圆形 厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不 到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC为宜 。
疟原虫的镜检技术
2020年4月29日星期三
2015年传染病涉及的文件
1 《中国腹泻病诊断治疗方案》 2 《山东省霍乱监测方案》 3《霍乱防治手册》（第6版） 4《细菌性和阿米巴痢疾诊断标准》
2015年传染病实验室总要求
• 以霍乱、手足口病、流感、人禽流感、流行性出血热 、布病、发热伴血小板减少综合征、碘缺乏病、疟疾 为主
• 以霍乱为重点的传染病、依托腹泻病门诊发现霍乱、 伤寒、副伤寒、菌痢、O157H7大肠杆菌和其他腹泻病 例，包括副溶血弧菌 空肠弯曲菌和小肠结肠炎耶尔森 氏菌等病原菌
• 逢泻必检 逢疑必检
• 检测率不低于30%，分离培养率必须达到10%
• 二级以及以上医疗单位每年至少分离5株肠道致病菌
截至2014年12月，辖区11个检测点应检血片7125 张，复检1316张（2张阳性）.1-12月各检测点复
血片制作与染色注意事项
●使用前载玻片一定要清洁，否则会影响 血片制作和镜检结果。
●厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫变 形，影响镜检结果。
●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助 于提高镜检质量。
● 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 ● 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。
血片的镜检
1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各 种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。
标准的疟疾厚薄血膜位置
各种不同的疟疾血片涂制法
标准血片（1人
）
门诊发热病人血片（1人
）
居民普查血片（2人）
血膜的制作
血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上
受检者的号码，以防差错，依次顺 序插入标本盒内。
染液的种类
染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应 用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉 氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的 主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化 所成的天青，所以称多色性染剂。
• 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者 退热后常查不到原虫。 末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状 体之后的10天左右。
取血部位和血量
采血部位和取血方法：
• 核对编号、信息 • 耳垂或无名指（婴幼儿母
趾或足跟），通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球消 毒取血部位，待酒精干后 ，用左手拇指和食指紧捏 耳垂上方或无名指指尖， 右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然 后用右手中指轻轻挤压出 血。厚血膜血量约一粒大 米（即火柴头）大小。
疟疾的危害
• 疟疾为全球危害最为严重的三大公共卫生疾病（艾 滋病、结核、疟疾）之一
• 政府的疟疾日
➢ 2000年起，每年4月25日为非洲疟疾日。 ➢ 考虑疟疾的严重危害，WHO在2007年5月世界卫生大会又将
该日定为世界疟疾日，旨在推动全球进行疟疾防治。2008年 4月25日为首个世界疟疾日。 ➢ 卫生部结合我国实际情况，决定将每年4月26日作为“全国 疟疾日”。