疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫的镜检技术
厚血膜间日疟小滋养体 形态
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Baidu Nhomakorabea
厚血膜恶性疟小滋养体形态
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厚血膜恶性疟小滋养体
• 恶性疟环状体在 发育不同阶段， 其个体大小有很 大变化。注意粗 环与间日疟环状 体的区别。
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厚血膜间日疟大滋养体 形态
疟原虫的镜检技术
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疟疾的实验室诊断技术
疟原虫的镜检技术 1.血片制作与染色。 2.厚、薄血膜中各期疟原虫的形态结构及其鉴
别要点。
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厚血膜中疟原虫的形态
在厚血膜中，各期疟 原虫的体积都略为 缩小，其中只有大、 小滋养体的形态有 较大改变，而裂殖 体和配子体的形态 则无明显变化。
厚血膜恶性疟配子体 形态
• 恶性疟原虫的配子体呈新 月形或腊肠形，如血膜干
燥较慢，则可缩成圆形， 核居中，疟色素围在核周， 外围一圈胞浆。此外，还 可见配子体的胞浆部分或 全部消失，只留下核和疟 色素，或核和胞浆均消失， 只留下一些疟色素。
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厚血膜红细胞形态
• 寄生的红细胞 经染 色后，因细胞内血 红蛋白溶解，轮廓 消失，但有时尚留 下残骸的“影子”或
人体疟原虫镜检技术
有时位于红细胞的 边缘。常见多个同 寄生一红细胞现象。 核： 红色一个,常有二个。 色素： 没有。
薄血膜疟原虫形态
恶性疟环状体
薄血膜中小滋养体形态特征
间日疟原虫小滋养体
约为红细胞直径的1／3； 环较粗大；核1个；2个核 和一个红细胞寄生2个环状 体，不如恶性疟原虫多见
薄血膜疟原虫形态
间 日 疟 未 成 熟 裂 殖 体
薄血膜疟原虫形态
恶性疟未成熟裂殖体
红细胞：大小正常，颜色较深，可 有茂氏小点。
大小： 较小。 胞浆： 规则，圆形或卵圆形，兰
色。 核： 分裂为二个以上，红色。 色素： 黄褐色颗粒，常集成黑褐
色团块。
薄血膜中裂殖体前期形态特征
间日疟原虫裂殖体前期
殖子12~24个，通常
殖子较小，8~32个，
16~18个，排列不规则； 通常8~18个，排列不
疟色素常集于一侧，
规则；疟色素成团快
黄褐色
状，黑褐色
薄血膜疟原虫形态
间日疟大（雌）配子体 形状大小：圆或椭圆，较大。 胞浆： 深兰色。 核： 一个，较小，深红色常
偏于一边，核周可见 明显不染色带。 色素： 黄褐色，均匀散在，数 目较多。
圆形或不规则；核分裂 为2个以上，空泡消失； 疟色素分布不匀
恶性疟原虫裂殖体前期
疟原虫检验专业技术标准
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
3. 如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
● 检查全部厚血膜未查见疟原虫 ● 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见
疟原虫
人类四种疟原虫的 基 本特征
感染人的疟原虫有四种:
恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale
红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大 差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比 前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查 一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞 排列整齐密集，无重迭的视野 镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫 期，不要笼统地记录为Pv或Pf。
三日疟 P.malariae
遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那 及印度部分地区，呈片状、块状分布
疟原虫检测标准操作程序
疟原虫检测标准操作程序
疟原虫检测操作程序
1.目的与原理
1.1 目的：检查血液中是否有疟原虫。
1.2 原理：瑞氏染色原理。瑞氏染料中含有美蓝和XXX
两种染料，前者为碱性，后者为酸性。它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调，以便于辨认。根据瑞氏染色的酸碱物质染色性不同，可将疟原虫各期的形态进行清楚染色，便于观察。高倍镜下一般可以观察到各种类型的疟原虫（如间日疟、三日疟、恶性疟），以及疟原虫的各期，如环状体（早期滋养体）、晚期滋养体、裂殖体、配子体等。
2.样本收集和贮存
2.1 原始样本：全血。
2.2 标本类型：EDTA抗凝血2ml。标本的采集应使用标
准一次性采血管，充分混匀，勿震荡。
2.3 保存条件：EDTA抗凝血尽快即时检测。
2.4 病人要求：必须在发烧时采血。
3.试剂
3.1 瑞氏染液：
3.1.1 试剂成分：瑞氏染料1.0g、无水甲醇500ml、甘油10ml。
3.1.2 配制方法：将瑞氏染料称量好后，放在乳钵中加少量无水甲醇匀速研磨至溶解。将研磨好的染液倾倒入试剂储存瓶中，倒入无水甲醇继续研磨，反复多次，直至乳钵中无瑞氏染料沉淀为止。配制好的染液放在37℃24小时后方可使用，放在阴凉干燥处，避光保存。
3.2 磷酸盐缓冲液PH6.4：
3.2.1 脱水Na2HPO4 1份：处理方法将Na2HPO4于蒸发皿上干燥（火燃烘烤）成粉末称量。
3.2.2 无水KH2PO4 2.6份：将脱水Na2HPO4 1份和无水KH2PO4 2.6份充分混合，边研磨边混匀。
3.2.3 将上述粉末1g加溶解于500ml去离子水中，混合均匀，方可使用。
疟原虫的镜检技术-制片染色
利用特异性抗体对疟原虫进行染色， 提高疟原虫的染色效果和特异性。
人工智能在疟原虫镜检中的应用
图像识别与分类
利用人工智能技术对显微镜下的疟原虫图像进行自动识别、分类和计数，提高镜 检的准确性和效率。
数据挖掘与分析
通过人工智能技术对疟原虫镜检数据进行分析和挖掘，发现数据间的关联和规律 ，为疟疾防控提供科学依据。
固定涂片时要选用适当的 固定剂，避免涂片脱落。
染色时要选用适当的染色 剂，按照染色剂的要求进 行操作，确保染色效果良 好。
镜检时要仔细观察疟原虫 的结构特征，避免误诊和 漏诊。
冲洗时要彻底去除多余的 染料和杂质，避免干扰观 察。
源自文库3
疟原虫镜检制片染色技 术
疟原虫镜检制片染色技术的原理
原理概述
疟原虫镜检制片染色技术是一种 用于检测疟原虫的病理学方法。 通过制备血液涂片，并对其进行 染色，可以观察到疟原虫的存在
疟原虫镜检技术的应用场景
在疟疾流行地区，疟原虫镜检技 术常用于对疑似疟疾患者进行快
速诊断，以指导治疗和防控。
在实验室研究中，疟原虫镜检技 术可用于研究疟原虫的生物学特 性、药物敏感性以及疫苗开发等
方面。
在公共卫生领域，该技术也可用 于监测和评估疟疾的流行趋势和
传播风险。
02
制片染色技术
制片染色技术的原理
疟原虫检测血涂片镜检法
疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法
ICS11.020
C62
WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准
WS/T 569—2017
疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法
Microscopic examination of blood films for malaria parasites
2017-08-01发布2018-02-01实施
前⾔
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。
本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。
疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法
1 范围
本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。
本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。
2 术语和定义
下列术语和定义适⽤于本⽂件。
2.1
疟原⾍Plasmodium spp
疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。
2.2
⾎涂⽚ blood films
将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。
3 仪器和器材
3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。
疟原虫镜检技术
疟原虫镜检技术
血片制作与染色
一、血片制作
（一）所需器材
1、载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。
2、采血针：使用一次性釆血针。
3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。
4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。
5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。
（二）采血部位及取血方法
采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
（三）涂制血膜
取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。用干棉球抹净玻片角上的血渍，
疟疾实验室镜检技术
疟疾实验室镜检技术
一、玻片的准备：
新的载玻片必须洗洁净后才可直接浸于95%的酒精中，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花毛的细布擦干，擦亮，妥善放置，勿使灰尘沾污。
二、厚、薄血膜的用血量：
厚血膜血量约为5立方毫米左右(即一小滴)，涂成边缘光滑之园形，直径约0.8—1.0厘米左右。
薄血膜血量只需0.5-1.0立方毫米左右,过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状长约2.5厘米，宽约2厘米。
三、血片的制作：
（1）、玻片的执持方法：无论在拭擦玻片，制作血片或染色血片时，手指仅可夹持玻片两侧缘，切匆触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血涂布不匀，厚血膜易于脱落。
（2）、厚血膜涂制：取洁净的载玻片和推片各一张，推片以右手拇指和食指持其二侧，取患者抗凝血滴在载玻片之适当位置，自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。
（3）、薄血膜涂制：以推片左端中央沾取薄血膜所需之血，与载玻片约成25-45度角，使血滴向二旁扩展至一定宽度时，立即向左边轻轻迅速推出即成薄血膜。推时速度之快慢和角度均影响血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀。无裂缝，无空隙。
四、血片的固定与脱膜：薄血膜染色前需先用甲醇或乙醇固定。固定后对厚血膜进行脱膜（厚血膜端向下放置在玻片架上，在自来水中脱膜20-30分钟）。现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜，直接染色。
五、血片的染色：将吉氏染液配成3%的稀释液，即水97 ml + 3 ml吉氏原液，PH值控制在7.0-7.2，染色25-30分钟。3%的稀释液必须现配现用，在30分钟内使用，最长不超过2小时。若制作的血片不多时，可以按比例来配置3%的稀释液。
11.疟原虫的显微镜检查_1
疟原虫的显微镜检查
汪子伟（杭州市第一人民医院中心实验室）
疟疾（malaria）是由人类疟原虫(Plasmodium)感染引起的寄生虫病，由雌性按蚊（Anopheles mosquito）叮咬传播。疟原虫先侵入肝细胞内发育繁殖，再侵入红细胞内繁殖，引起红细胞成批破裂而发病。临床上以反复发作的寒战、高热、汗出热退为特点，并常出现贫血、肝脾肿大。因疟原虫虫株、感染程度、机体免疫状况和反应性等差异，临床症状和发作规律表现不一。
作为一种古老的疾病，早在公元二千多年前，《黄帝内经·素问》中即有《疟论篇》和《刺论篇》等专篇论述疟疾的病因、症状和疗法，并从发作规律上分为“日作”、“间日作”与“三日作”。然而，直到1880年法国人Laveran在疟疾病人血液中发现疟原虫；1897年英国人Ross发现蚊虫与传播疟疾的关系，这时其病因才弄清楚。
疟疾是目前世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，危害极大。据世界卫生组织统计，目前仍有92个国家和地区处于高度和中度流行，每年发病人数为1.5亿，死于疟疾者150万人。它主要分布于热带、亚热带各国，我国主要在华南、华中(特别是云南和海南)。我国1949年前疟疾连年流行，尤其南方，流行猖獗，病死率很高。解放后，全国建立了疟疾防治机构，广泛开展了疟疾的防治和科研工作，疟疾的发病率已显著下降。历代战争史实表明疟疾对军事行动影响颇巨，低疟区部队进入高疟区，常发生大量非战斗减员。
疟原虫属原生动物亚界--顶复门--孢子纲--疟原虫属。寄生人类的疟原虫有：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。疟原虫通过蚊叮咬而感染人，疟疾的典型临床表现是周期性寒战、发热和出汗。疟疾诊断主要靠外周血涂片检查。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术
1）薄血膜（thin blood film）制作方法
（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血
（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。
2）厚血膜（thick blood film）制作方法
（1）采血同薄血膜法
（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。
3）固定、染色
（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。
滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。
4）注意事项
(1）玻片要洁净，无油脂。血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。
(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。
(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜
疟原虫操作规程
1. 实验原理
应用瑞氏染色法对制备好的厚血片进行染色后在显微镜下查找疟原虫。
2. 标本采集
2.1标本采集前病人准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20h 左右采血。
2.2标本种类：全血或末梢血
2.3标本要求：厚血片的溶血要及时。
3. 标本储存：厚血片的放置期限在夏季不超过48h，冬季不超过62h。
4. 标本运输：室温运输。
5. 标本拒收标准：细菌污染。
6. 操作步骤
6.1 在洁净玻片上，滴患者血液2滴。
6.2 用推片角将血液由内向外转涂成直径约1cm、厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。
6.3 在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟。脱去血红蛋白的血膜呈浅灰色，倾去溶血液。
6.4 不必待干，进行瑞氏染色。
6.5 干后镜检。
7. 结果判断与分析：在油镜下观察20个视野或以上才能报告“未检出疟原虫”；发现虫体后还应在薄血片上进行分类鉴别。
8. 临床意义：本实验有利于提高疟原虫的阳性检出率。
9. 操作性能：快速简便、阳性检出率高、利于人群普查初筛
10. 方法局限性
10.1 易受溶血不完全的影响。
10.2 经验缺乏者易受其他杂物的影响。
10.3 存在主观判断的失误
10.4 不易鉴别出疟原虫的种类。
11. 参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程（第二版）.1997,85-86
12. 注意事项
12.1 染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣冲走。
12.2 注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。
疟原虫镜检规章制度
疟原虫镜检规章制度
第一章总则
第一条为规范疟原虫镜检工作，提高疟疾诊断准确率，保障患者健康，特制定本规章制度。
第二条本规章制度适用于医疗机构、检验检测机构开展疟原虫镜检工作。
第三条疟原虫镜检应遵守相关法律法规和相关标准，确保检测结果准确可靠。
第四条医疗机构和检验检测机构应建立健全疟原虫镜检管理制度，保证检测人员熟练掌握检测技术。
第五条疟原虫镜检工作应当严格遵守检验检测质量管理规范，确保检测结果准确。
第六条医疗机构和检验检测机构应当配备专业的技术人员从事疟原虫镜检工作。
第七条疟原虫镜检工作应当遵循“安全、准确、迅速”的原则，保证检测工作质量和效率。
第八条医疗机构和检验检测机构应当建立健全疟原虫镜检的质量控制和质量保证体系，确保检测结果可靠。
第二章疟原虫镜检设备和耗材
第九条医疗机构和检验检测机构应当购置标准符合要求的疟原虫镜检设备，并定期维护和保养设备。
第十条医疗机构和检验检测机构应当使用符合要求的疟原虫镜检耗材，保证检测过程的质量和准确性。
第十一条疟原虫镜检设备和耗材应当定期检测和校准，确保检测结果准确可靠。
第三章疟原虫镜检人员
第十二条从事疟原虫镜检工作的人员应具有相应的专业技能和执业资格，熟练掌握检测技术。
第十三条疟原虫镜检人员应当遵守相关法律法规和相关标准，保证检测结果的准确性和可靠性。
第十四条疟原虫镜检人员应当接受规范的培训，不断提升自身的专业水平和技能。
第十五条疟原虫镜检人员应当定期进行健康体检，确保身体健康，保障检测工作的顺利进行。
第四章疟原虫镜检流程
第十六条疟原虫镜检工作应当遵循严格的操作流程，确保检测过程准确无误。
疟原虫镜检技术
核:红色，二个以上。 疟色素:黄褐色,分布不
均匀。
薄血膜间日疟原虫形态
4.间日疟原虫成熟裂 殖体
红细胞：胀大，褪色 ，可见薛氏小点。
大小：大于正常红细 胞。
胞浆和核：裂殖子 12~24个平均16个 ，排列不规则， 核红色，胞浆浅 兰色。
疟色素：黄褐色常集 于疟原虫的一边。
恶性疟原虫
●恶性疟原虫红细胞外期发育约需要5天，大约感染 后第6天，在周围血液中查见疟原虫。
●恶性疟原虫在红细胞内期发育最初24小时内，一 般能在周围血液中查到环状体，亦可能查到大滋 养体。
●24小时后聚集在肝、脾、脑、骨髓等内脏的毛细 血管内发育进行裂体生殖。恶性疟原虫裂体生殖 周期36～48小时。
薄血膜间日疟原虫形态
5.间日疟原虫雌 （大）配子体
形状大小：圆或椭 圆，大于正常红 细胞。
胞浆：深蓝色。
核：一个，较小， 致密，深红色， 位于一边。核周 可见明显不染色 带。
疟色素:黄褐色,数目 较多，均匀散在 分布。
薄血膜间日疟原虫形态
6.间日疟原虫雄 （小）配子体
形状大小：圆形， 大于正常红细胞。
2. 间日疟原虫大滋养 体（ T ）
红细胞：胀大褪色，出 现分布均匀，数目较 多，红色薛氏小点。
大小：较大。 胞浆：不规则，浅蓝色
疟原虫的镜检技术
01
02
03
04
厚血膜法
将血液涂抹在载玻片上形成厚 血膜，经过染色后镜检，适用 于疟原虫密度较低的样本。
薄血膜法
将血液涂抹在载玻片上形成薄 血膜，经过染色后镜检，适用 于疟原虫密度较高的样本。
QBC法
使用定量缓冲液稀释血液，通 过特定滤膜过滤后，在滤膜上 形成疟原虫“玫瑰花环”结构 ，便于观察和计数。
正确使用显微镜步骤
01
02
03
04
05
将载玻片放在载物台上， 用压片夹固定。
转动转换器，将低倍物镜 对准通光孔。
调节光圈和反光镜，使视 野亮度适宜。
转动粗准焦螺旋，使镜筒 缓缓下降，直到物镜接近 载玻片。
一只眼注视目镜内，同时 逆时针方向转动粗准焦螺 旋，使镜筒缓缓上升，直 到看清物像为止。再略微 转动细准焦螺旋，使看到 的物像更加清晰。
100%
流行病学调查
通过对人群进行疟原虫检测，可 以了解疟疾的分布情况、流行趋 势和传播途径等信息，为制定防 治策略提供依据。
80%
药物疗效评价
在治疗过程中进行疟原虫检测， 可以观察药物的疗效和患者的பைடு நூலகம் 复情况，及时调整治疗方案。
02
镜检技术原理及方法
显微镜原理及构造
显微镜原理
利用光学透镜组合，将微小物体 放大成像，以供人眼观察。
疟原虫镜检技术操作规
疟原虫镜检技术操作规范
1.目的
指导实验室检验人员正确使用和维护全显微镜，完成疟原虫检测项目
2、范围
适用于实验室检验人员
3、职责
检验人员需按照本操作规程使用和维护全显微镜, 确保仪器在最佳状态下运行，以便得到正确的结果，提高结果准确率。
4、作业指导
4.1.需用器材
显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）、镜油、擦镜纸、二甲苯或酒精乙醚
4.2操作步骤
4.2.1、血膜上滴加镜油滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。
4.2.2、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。
4.2.3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，
自左而右，逐个视野顺序查看。发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。
4.3、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。
4.4、注意事项
4.4.1染色前血膜的保存
新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。
疟原虫血涂片镜检技术规范
附件3
疟原虫血涂片镜检技术规范
一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查
同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。薄血膜可用于原虫形态鉴定。以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。
二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查
同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。其他参见吉氏液染色法。
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疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。
一、血片制作
（一）所需器材
载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）
采血针采用一次性采血针。
玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。
皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。
记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。
（二）操作步骤
1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。如图1
2、采血
采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。
3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。如（图1）、（图2）
疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2
薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。
二、固定
（一）所需器材
1、甲醇
2、器具玻璃棒、吸管
（二）操作步骤
薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。
三、染色
（一）所需器材
1、吉氏染液（原液）
2、器具染色用的盘子、染色缸、烧杯、吸管若干。
3、染色及冲洗用水蒸馏水、冷开水、自来水、pH7.2缓冲液。
（二）操作步骤
单片染色单张血膜染色可取蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水或pH7.2的缓冲液1ml加入吉氏染液原液1-2滴，混合均匀后浓度约为2～5％的吉氏稀释液，均匀滴在厚、薄血膜上，染色20～30分钟。
注意：1、浓度约为2～5％的吉氏稀释液现配现用；2、新鲜厚血膜充分干燥后才能染色；3、厚、薄血膜一起染色。
多片染色：用吉氏染液成批血膜染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2～5％吉氏染液(2ml吉氏原液与98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入pH7.2缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。
四、冲洗
染色后不要将玻片上残余染液直接迅速倒掉，应将玻片连同玻片
上的染液一起放在水中轻轻漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
五、镜检
（一）器材
1、显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）。
2、镜油
3、擦镜纸
4、二甲苯或酒精乙醚
（二）操作步骤
1、血膜上滴加镜油滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。
2、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。
3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，自左而右，逐个视野顺序查看。发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。
5、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。
五、注意事项
1、染色前血膜的保存
新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。
2、患者资料应登记详细，确保能追踪随访，个案调查、登记、统计等资料应有专人负责保管。
3、镜检人员应加强自身防护，操作戴手套、穿工作服。
4、镜检室应保持环境及器具的整洁，试剂和染色用具要顺序放置在固定的操作台上。
5、显微镜用毕，取擦镜纸沾取二甲苯或酒精乙醚擦拭油镜头清除镜油，并清洁载物台及目镜。显微镜保存做到防尘、防潮、防霉。
6、医疗垃圾按医院废物管理相关规范进行处置。
疟原虫镜检操作步骤示意图