疟原虫显微镜镜检技术

2.
核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红 色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只 有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配 子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗 红或紫红色。 3. 疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而 异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶 性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；三日疟原 虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与 间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集 成团块。
疟原虫显微镜镜检技术
东安县疾病预防控制中心 周永玲 2011.07.10
疟疾简介
疟疾是一种古老的传染病,俗 称“冷热病”、“打摆子”、 “发疟子”、“脾寒”、 “瘴气”等，是由疟原虫寄 生于人体引起的传染性寄生 虫病。
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [Plasmodium vivax，P.v] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o] 我国主要是间日疟常见，恶性疟次之， 三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。

（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚 未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。 染液存放时间越久，染色力越强。通常在 染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶 子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。
影响染色效果的因素

（3）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染 液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化 产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解， 但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生 沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用， 一般在半小时内染色力最强。
疟原虫血片检查结果确定
检查全部厚血膜未查见疟原虫者判为 阴性。 显微镜下查见疟原虫，根据疟原虫形 态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵 形疟或混合感染。

制作血膜的注意事项

1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制 作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍 或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘， 不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产 生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻 片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均 匀一致。
影响染色效果的因素


血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片 制作质量好坏等有关外，还受到以下几个 因素的影响： （1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油 如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而 影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇 和中性甘油，而且在配制时所用的器具必 须干净而无水份。
影响染色效果的因素



镜检疟原虫方法简述 19世纪后期，显微镜的出现使 人们不断发现了传染病的病因。 1880年法国军医拉韦朗第一次 见到并描述了人红细胞内的疟 原虫，至此才解开了困扰人们 数千年的疟疾的病因之谜。
镜检疟原虫方法简述
目前用于疟疾诊断的实验室检测包括 病原学检查、免疫学检测和分子生物 学检测三类。镜检疟原虫由于具有操 作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等 优点，广泛用于疟疾的病原学诊断已 愈近一个世纪，仍是目前最常用的方 法，也是我国疟疾诊断标准确定的实 验室检查方液的配制

将瑞氏染剂粉 1g 置于研钵内，加入 15ml 甘油充 分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用 500ml甲醇 洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置 室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。 此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液 效果稳定，又不能大量血片染色，可用于门诊应 急血片用。
制作血膜的注意事项

3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火 烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天 标本尽可能24~48小时内固定染色；冬天 也不能超过72小时。放置时间越久，厚血 膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及 时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1~3分 钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干 固定后装入盒内盖严，待以后染色。
血膜的制作（取血操作）
取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头， 通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针 采血，一人一针，避免血传疾病）。先用 75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻 动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干 后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右 手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米， 不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向 挤压出血。
疟原虫在RBC内的形态 （三期六种形态）
滋养体期：大、小滋养体 裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体 配子体期：雌、雄配子体

人体疟原虫的基本结构
疟原虫基本构造为 细胞质（胞浆）、核和 疟色素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长 大，细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到 大滋养体阶段，胞浆呈阿米巴样活动，胞 浆内有空泡。
制作血膜的注意事项

2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血 膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向 一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不溶血和 着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意 防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜， 干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制 标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发 后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定， 不能溶血或染色效果不佳。
用于检查疟原虫的血涂片有两种： 一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜。 一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。 薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上 面。
血膜的制作（取血时间）

取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查 时可不考虑取血时机。 在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握 适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周 血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环 状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易 辩认，为诊断的有利时机；36~48 小时，可检 出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时 内取血，初发患者退热后常查不到原虫。
4. 被寄生的红细胞 •被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。 疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏 点。 •被恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微 缩小，红细胞上有时见到茂氏点。 •被三日疟原虫寄生的红细胞大小正常，红细 胞上可见到齐氏点。 • 被卵形疟原虫寄生的红细胞稍胀大或不胀大， 呈卵形或一端呈伞矢状，薛氏点出现较早， 于环状体阶段便可查见。
影响染色效果的因素

（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻 片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出， 并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
疟原虫形态特征和鉴别要点



在RBC内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种 的重要依据 疟原虫基本构造相同--细胞膜、质、核 瑞氏或姬氏染色：核染成紫红色，胞质呈 兰色，疟原虫消化血红蛋白产物-疟色素呈 棕黄色 疟原虫在RBC内各期形态各不相同
镜检目的与意义


疟疾诊断标准中把疟疾病例分为疑似病例、 临床病例、确诊病例和带虫者，前两者依 据流行病学史和临床表现即可做出诊断， 而后两者需通过发现病原体方能做出诊断。 通过对发热病人血检达到确诊疟疾病例。 及时发现传染源和明确感染的疟原虫种类， 以能针对虫种选择正确的治疗方案。
血片镜检
血片制作

血片的染色 吉氏染液血片染色方法 （推荐使用此方法）


先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。在 固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白可用滴管滴 水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倾去，晾干后 进行染色。 成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒 入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫 升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染 液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻 轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片 标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。


在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜 中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以 识别。 学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上 掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。 镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫 分类时参考和血片编号之用。 镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检， 当发现疑难问题时可调换10X目镜进行观察。 检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下， 自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍 叠一个视野顺序地查完整个血膜。
先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几 滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水 滴。在薄血膜上加瑞氏染液 5 ～ 8 滴，染色 1 ～ 2 分钟。然后再加 5 ～ 8 滴蒸馏水于薄血 膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后， 把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色 10 分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干。
血片的镜检
影响染色效果的因素


（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。 （5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
血膜的制作（取血操作）
取血量及涂片法（涂片操作）
薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张 平置在桌上，以左手拇指，食指夹 持载玻片两端（手指切勿接触玻片 表面），用另一张边缘平滑（最好 为磨口边缘）的载玻片做推片，用 推片一端边缘的中点从取血部分取 约 1 微升的血量（相当于 1/4 火柴 头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，并形成 25~30 度夹角，待 血液向两侧扩展约 2 厘米长度时， 均 匀 而 迅 速 地 轻 轻向左推出 （ 约 2.5厘米长），整个血膜成舌形。
血片的染色
单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用 2%吉氏染液稀释液1~2毫升，滴入血片标本 上染色30分钟左右；或用中性蒸馏水1毫升， 加吉氏母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标 本上，染色10~20分钟，然后用清水轻轻将 片上的染液冲洗干净，（切勿先倒掉染液 再用水冲洗）晾干镜检。