疟原虫显微镜镜检技术

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疟原虫显微镜镜检技术
东安县疾病预防控制中心 周永玲 2011.07.10
疟疾简介
疟疾是一种古老的传染病,俗 称“冷热病”、“打摆子”、 “发疟子”、“脾寒”、 “瘴气”等,是由疟原虫寄 生于人体引起的传染性寄生 虫病。
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [Plasmodium vivax,P.v] 三日疟原虫[P.Malariae,P.m] 恶性疟原虫 [P.Falciparum,P.f] 卵形疟原虫[P.Ovale,P.o] 我国主要是间日疟常见,恶性疟次之, 三日疟偶尔发现,卵形疟已无病例报告。
2.
核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红 色,呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密,只 有在个别发育阶段较为疏松,例如间日疟原虫雄配 子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝,使核呈暗 红或紫红色。 3. 疟色素 不着色,颜色和颗粒的形状,因疟原虫种类而 异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状,黄褐色;恶 性疟原虫的色素颗粒呈细砂状,黑褐色;三日疟原 虫的色素呈砂粒状,深褐色;卵形疟原虫的色素与 间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集 成团块。
疟原虫血片检查结果确定
检查全部厚血膜未查见疟原虫者判为 阴性。 显微镜下查见疟原虫,根据疟原虫形 态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵 形疟或混合感染。

制作血膜的注意事项

1. 玻片清洗时,避免玻片碰撞、磨损。制 作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍 或污垢。制片时,手指只能持载片的边缘, 不能接触玻片表面,以免油污使薄血膜产 生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻 片边缘一定要平滑,才能使推出的血膜均 匀一致。

(2)染液的新旧 新配制的染液因色素尚 未充分溶解,染色力较弱且常呈现偏碱性。 染液存放时间越久,染色力越强。通常在 染液配制1~2周后才使用,盛装染液的瓶 子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。
影响染色效果的因素

(3)染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染 液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化 产生的天青,三者能在酒精溶液中溶解, 但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生 沉淀。因此,必须在稀释染液当时使用, 一般在半小时内染色力最强。
影响染色效果的因素

(7)染色后不要直接将染液倒掉,应沿玻 片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出, 并轻轻冲洗,以免染液色素颗粒沾污血膜。
疟原虫形态特征和鉴别要点



在RBC内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种 的重要依据 疟原虫基本构造相同--细胞膜、质、核 瑞氏或姬氏染色:核染成紫红色,胞质呈 兰色,疟原虫消化血红蛋白产物-疟色素呈 棕黄色 疟原虫在RBC内各期形态各不相同



镜检疟原虫方法简述 19世纪后期,显微镜的出现使 人们不断发现了传染病的病因。 1880年法国军医拉韦朗第一次 见到并描述了人红细胞内的疟 原虫,至此才解开了困扰人们 数千年的疟疾的病因之谜。
镜检疟原虫方法简述
目前用于疟疾诊断的实验室检测包括 病原学检查、免疫学检测和分子生物 学检测三类。镜检疟原虫由于具有操 作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等 优点,广泛用于疟疾的病原学诊断已 愈近一个世纪,仍是目前最常用的方 法,也是我国疟疾诊断标准确定的实 验室检查方法(WS259-2006)。
血片的染色
单张血片染色:薄血膜经固定干燥后,用 2%吉氏染液稀释液1~2毫升,滴入血片标本 上染色30分钟左右;或用中性蒸馏水1毫升, 加吉氏母液1~2滴,混合均匀后滴入血片标 本上,染色10~20分钟,然后用清水轻轻将 片上的染液冲洗干净,(切勿先倒掉染液 再用水冲洗)晾干镜检。
瑞氏染液的染色方法:


在学习镜检疟原虫之前,必须先对正常厚薄血膜 中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以 识别。 学习镜检疟原虫,首先要学看薄血膜,在基本上 掌握薄血膜中疟原虫形态后,才学习镜检厚血膜。 镜检疟原虫一般只查厚血膜,薄血膜仅作为原虫 分类时参考和血片编号之用。 镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检, 当发现疑难问题时可调换10X目镜进行观察。 检查时应从厚血膜的上缘开始,使血膜从上而下, 自左至右,由右至左,一行接一行,一个视野稍 叠一个视野顺序地查完整个血膜。
血膜的制作(取血操作)
取血方法 采血部位一般人为耳垂,指头, 通常在耳垂取血(现场取血建议用大头针 采血,一人一针,避免血传疾病)。先用 75%酒精棉球消毒取血部位(冬季用手捻 动耳垂使其充血后再行消毒),待酒精干 后,用左手拇指和食指紧捏耳垂上方,右 手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米, 不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向 挤压出血。
影响染色效果的因素


(4)染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深,从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著,但颜色常偏碱;染液浓度 过低则染色时间久,颜色偏酸,薛氏点不 明显或消失。 (5)染色时间 染色时间长染色效果好, 反之较差。室温高则着色快,染色时间可 略缩短,气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
镜检目的与意义


疟疾诊断标准中把疟疾病例分为疑似病例、 临床病例、确诊病例和带虫者,前两者依 据流行病学史和临床表现即可做出诊断, 而后两者需通过发现病原体方能做出诊断。 通过对发热病人血检达到确诊疟疾病例。 及时发现传染源和明确感染的疟原虫种类, 以能针对虫种选择正确的治疗方案。
血片镜检
血片制作
疟原虫在RBC内的形态 (三期六种形态)
滋养体期:大、小滋养体 裂殖体期:成熟、未成熟裂殖体 配子体期:雌、雄配子体

人体疟原虫的基本结构
疟原虫基本构造为 细胞质(胞浆)、核和 疟色素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色,随着虫体发育长 大,细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到 大滋养体阶段,胞浆呈阿米巴样活动,胞 浆内有空泡。
影响染色效果的因素

(6)染色用水 染液的稀释用水和染色后 冲洗用水应选择Ph7.0~7.2清洁水,通常 使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水,以 及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。 如果偏酸或偏碱,可用缓冲蒸馏水调整。 染色后发现血膜颜色偏蓝(偏碱)或偏红 (偏酸)时,可用与之相反的酸、碱度水 冲洗血片予以纠正。
4. 被寄生的红细胞 •被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。 疟原虫发育至阿米巴样体,红细胞出现薛氏 点。 •被恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微 缩小,红细胞上有时见到茂氏点。 •被三日疟原虫寄生的红细胞大小正常,红细 胞上可见到齐氏点。 • 被卵形疟原虫寄生的红细胞稍胀大或不胀大, 呈卵形或一端呈伞矢状,薛氏点出现较早, 于环状体阶段便可查见。
用于检查疟原虫的血涂片有两种: 一种是将血液涂呈薄膜状,称薄血膜。 一种是血液涂成圆盘,称厚血膜。 薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上 面。
血膜的制作(取血时间)

取血时机 现症病人一般可随时取血,疟疾普 查 时可不考虑取血时机。 在诊断或需要某期疟原虫作标本时,则应掌握 适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时,外周 血液中主要可见环状体期;发作后数小时,环 状体发育到滋养体期,疟色素形成,形态较易 辩认,为诊断的有利时机;36~48 小时,可检 出裂殖体;发作一、二次后,配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时 内取血,初发患者退热后常查不到原虫。
通常是将厚、薄血膜涂在 一张载片上。方法是将载 片分为 6 等分,第 1 、 2 格 备贴标签及编号用;厚血 膜涂在第 3 格中央,薄血 膜涂在第4格前缘至第6格 中部。作为标本的血片每 张玻片涂厚、薄血膜各 1 个;门诊和发热病人血片 每片 1 人,涂 2 个厚血膜 1 个薄血膜,以防血膜脱落 而影响检查。
制作血膜的注意事项

3. 血膜让其自然干燥,切忌用太阳晒或火 烤,干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天 标本尽可能24~48小时内固定染色;冬天 也不能超过72小时。放置时间越久,厚血 膜越不易脱血,染色效果也差。若不能及 时染色,薄血膜宜先用甲醇固定(1~3分 钟)然后用过滤清水对厚血膜溶血,晾干 固定后装入盒内盖严,待以后染色。
正确的推片姿势
取血量及涂片法(涂片操作)
厚血膜 用推 片的一角, 从取血部位刮取约4微升 血量(相当于火柴头 小),使血滴与平置的 载玻片接触,再由里向 外一个方向旋转,转 2~4圈,涂成直径 0.8~1厘米大小圆形厚 血膜,血膜厚薄均匀, 过厚易于脱落,过薄达 不到检出率的要求。
涂制厚、薄血膜的位置
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影响染色效果的因素


血片染色好坏除了与玻片是否清洁,血片 制作质量好坏等有关外,还受到以下几个 因素的影响: (1)染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油 如果不纯,常使配制的染液偏酸或偏碱而 影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇 和中性甘油,而且在配制时所用的器具必 须干净而无水份。
影响染色效果的因素
制作血膜的注意事项

2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内,厚血 膜未干前勿使标本盒倾斜,以免血膜倾向 一侧,造成血膜厚薄不均,厚处不溶血和 着色而影响检查结果;晾干血膜时应注意 防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜, 干后应及时装入标本盒并盖严,新的木制 标本盒需敞开放置一段时间,让木醇挥发 后才能使用,以免厚血膜红蛋白被其固定, 不能溶血或染色效果不佳。
血膜的制作(取血操作)
取血量及涂片法(涂片操作)
薄血膜 取洁净的载玻片2张,1张 平置在桌上,以左手拇指,食指夹 持载玻片两端(手指切勿接触玻片 表面),用另一张边缘平滑(最好 为磨口边缘)的载玻片做推片,用 推片一端边缘的中点从取血部分取 约 1 微升的血量(相当于 1/4 火柴 头大小),使血滴与平置的载玻片 接触,并形成 25~30 度夹角,待 血液向两侧扩展约 2 厘米长度时, 均 匀 而 迅 速 地 轻 轻向左推出 ( 约 2.5厘米长),整个血膜成舌形。

血片的染色 吉氏染液血片染色方法 (推荐使用此方法)


先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,待干后进行染色。在 固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白可用滴管滴 水于厚血膜上,待血膜呈灰白色时,将水倾去,晾干后 进行染色。 成批血片染色:将已固定薄血膜的血片插入染色缸,倒 入2%吉氏染液稀释液(2毫升原液加中性蒸馏水98毫 升稀释均匀即成),同时对厚薄血膜染色30分钟(如染 液不合标准时,得酌情增减染色时间),然后用清水轻 轻将染液冲去,再用清水轻轻冲洗一次,干净后将血片 标本(血膜面朝下)插于晾干板上,待干镜检。
标准的疟疾厚薄血膜片位置
血片的染色
一、吉氏染液母液配制
取吉氏粉0.5克置于研钵中,加少量甘油充分研磨, 边加边磨,至25毫升加完为止,倒入60或100毫 升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量无水 甲醇,洗去甘油浓液混入瓶内,至25毫升甲醇洗 净钵中甘油染液为止,塞紧瓶塞,充分摇匀,置 于55~60℃水浴中2小时,或室温内3~5天,每 天用力摇动5分钟,即成原液。吉氏染液是目前较 优良的血膜染剂,即使在炎热天气中,亦可经久 不变。
疟原虫薄血膜形态鉴别
(吉氏染色)
间日疟小滋养体--环状体
较大,约占寄生红细胞的1/3,胞浆较薄,一个核, 很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2 个核。
间日疟滋养体-大滋养体

经8~10小时,虫体增大,胞质增多,伸出伪足,阿米巴样, 常含空泡。
血片的染色
二、瑞式染液的配制

将瑞氏染剂粉 1g 置于研钵内,加入 15ml 甘油充 分研磨后,倒入有塞玻璃瓶中,再用 500ml甲醇 洗出研钵中的甘油溶液,倒入瓶中,摇匀后,置 室温下,每天摇动5分钟,3天后即可使用。 此方法染色的时间短,但染色效果不如吉氏染液 效果稳定,又不能大量血片染色,可用于门诊应 急血片用。
先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限,滴几 滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水 滴。在薄血膜上加瑞氏染液 5 ~ 8 滴,染色 1 ~ 2 分钟。然后再加 5 ~ 8 滴蒸馏水于薄血 膜上,用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后, 把染液引到厚血膜上,使厚血膜再染色 10 分钟。用清水轻轻冲去染液,晾干。
血片的镜检
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