鱼类线粒体 (1)

文献综述题目：鱼类线粒体及线粒体控制区的研究进展沈阳农业大学学士学位论文文献综述鱼类线粒体及线粒体控制区的研究进展摘要：线粒体DNA是动物体内唯一发现的核外遗传物质。

与其他动物相同，鱼类线粒体全长约16.5kbp 左右，分为编码区和非编码区两大部分，编码区编码37个基因，非编码区即线粒体基因组的控制区（也称D-loop），其碱基替换率比线粒体DNA其它区域高5-10倍，遗传上是高变区。

遗传学上可根据线粒体控制区的特点和特性，可利用限制性酶切片段长度多态性技术（RFLP）、PCR技术和测序技术等方法分析物种的遗传多样性和其分类地位。

线粒体DNA控制区序列在研究鱼类种内遗传分化中具有重要意义，为传统鱼类形态学分类提供了分子生物学证据，为地质演化和鱼类进化的关系提供论据，为物种保护和渔业管理提供科学理论基础。

关键字：鲢鱼；线粒体DNA；D-loop区；分类地位几乎所有的脊椎动物的细胞中都含有线粒体（mitochondria）这种细胞器，它自身携带DNA，可自我复制、表达，并有核基因编码的蛋白质和酶从细胞质输入线粒体，共同完成生物氧化的理功能。

动物的线粒体DNA（mtDNA）是共价闭合的双链DNA，其基因结构简单，一级结构的碱基突变率高。

近年来，随着DNA序列分析、限制性酶切片段长度多态性技术（RFLP）及PCR技术的应用和发展，mtDNA在动物起源、种群分化与系统发生、分类及遗传瓶颈效应等方面取得了重要进展。

1 线粒体概述与其他动物相似，鱼类线粒体基因组的长度大多在15-20kb左右，环状双链，根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不同分为重链（H链）和轻链（L链），由2个rRNA 基（16S rRNA、12S rRNA）、22 个tRNA基因、控制区（D-Loop环区）和轻链复制起始区和13个疏水蛋白质基因。

13个蛋白质因是细胞色素b（Cyt b）基因，2个ATP酶的亚基，3个细胞色素c（Cyt c）氧化酶的亚基（COI，COII，COIII），7个NADP还原酶的亚单位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6），除一个蛋白质基因（ND6）和8个tRNA基因由L链编码外，其余的大部分基因都由H链编码[1]。

各基因间排列紧密，非编码序列比例小，基因排列的顺序基本一致，只有鸟类（如鸡）稍有改变，基因内不含内含子，碱基的使用节约、高效[2]。

2 线粒体DNA的遗传特性MtDNA与核DNA相比，具有无组织特异性、严格的母系遗传、基因组拷贝数多，进化速率快等独特的遗传特征。

在mtDNA研究中，对同一个体的肾、肝、心、胎盘和皮肤等不同组的比较表明，线粒体DNA的结构无组织特异性；动物的mtDNA一般是母系遗传，尤其是高等动物，虽然在某些高等动物的受精过程中，精子可以携带约100个拷贝的mtDNA进入卵子，但卵子内含有约10个以上的mtDNA分子；mtDNA拷贝数多，每个细胞中有1000-10000个拷贝，容易从组织中分离提纯，试验技术简单，重复性较好；mtDNA的进化速率是单拷贝DNA的5-10倍，群体内变异大。

鱼类线粒体及线粒体控制区的研究进展MtDNA基因组内不同区域的进化速率不同，适合不同水平的进化研究。

进化方式主要为碱基替换，包括转换和颠换，很少发生基因重排。

这是因为动物mtDNA复制酶r-多聚酶，不具备校对能力，碱基误配率高，并缺乏修复机制；而mtDNA代增时间短，快速增殖为突变提供了更多的机会；而mtDNA无核蛋白保护，易受代谢中间产物诱变而发生突变：mtDNA的选择压力小，突变较容易固定下来。

MtDNA在同一物种的群体内变异大，使其在边缘种间、种内遗传分析的灵敏度提高；分子量较小，动物mtDNA 的分子大小一般为15-20kb，处于限制性内切酶的分析范围。

MtDNA基因组结构比较简单、稳定，同核DNA相比，mtDNA编码效率较高，蛋白质编码基因无内含子，基因分隔常少于10bp，两基因间几乎没有空间，有时相互交搭[3-5]。

因此，mtDNA逐步成为构建物种系统发生的重要手段。

近年来，DNA序列分析、RFLP及PCR技术的应用和发展促进了mtDNA在物种起源与系统发生、种内遗传分化和遗传瓶颈效应等各方面的研究[6]。

3 线粒体控制区MtDNA中的12S rRNA、16S rRNA等rRNA基因、D-loop、Cyt b和ND4等基因常被选做为分子标记[7-8]。

其中控制区（control region）又称D-环区（D-loop，displacement loop region），一般位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之间，是整个mtDNA基因组序列和长度变异最大的区域,其进化速率是mtDNA其他区段的2-5倍[9]，但其中也包含一些保守片段。

控制区包括终止结合序列区（terminal associated sequences，TAS），H-链复制起始区OH，保守序列框（conserved sequence blocks，CSB），L-链启动子（L-strand promoter，LSP）及H-链启动子（H-strand promoter，HSP）。

由于控制区包含OH，LSP，HSP等重要元件，所以控制区长度的变异势必会影响mtDNA的复制和转录，从而影响到整个生物体的代谢速率。

控制区是mtDNA变化最复杂，却又被了解最少，也最吸引人的区域，对控制区结构功能的研究将有助于了解DNA的复制、转录的机制和进化的规律。

控制区的终止结合序列区包含与DNA复制终止相关的序列TAS，位于控制区的5’端，拷贝数在l-8个之间，是mtDNA长度变异的主要原因。

拷贝数不仅种间有差异，种内个体间也存在差异，只是小于种间。

一般每个重复序列中都含有一个保守的TAS，TAS 可能是与H-链复制终止有关的信号。

刘焕章等人[10]在对比多种鱼类的序列后确定鱼类中的ETAS为TACATA T-------- ATGTATTATCACCAT-ATAT-TATATTAACCAT（“-”表示发生变异的碱基，即转换、颠换或缺失）并在研究鳑鲏鱼类的mtDNA控制区的结构时发现彩副橘（Paracheilognathus imberbis）的终止结合序列区为232bp，没有明显的重复、长片段的缺失和插入，发现一个TAS，其中含有核心序列ACAT；高体鰟鲏（Rhodeus ocellatus）终止结合序列区为340bp，其中有两处不完全重复，都含有多个TAS 的反向互补序列ATGT；大鳍鱊（Acheilognathus macropteerus）的终止结合序列区为442bp，其中有一段59bp的不完全重复，重复序列也含有TAS的反向互补序列AT-GT。

郭新红等沈阳农业大学学士学位论文文献综述人[11]识别了不同倍性鲤科鱼中的ETAS为TACATAT -------- ATGTATTATCACCAT ----- TATATTAACCA-，并发现红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫中分别含有4个TACAT核心序列，日本白鲫中含有3个TACAT核心序列，三倍体湘云鲤含有1个TACAT 核心序列，而斑马鱼（Brachydanio rerio）中含有6个TACAT核心序列。

Southern等[12]首次在mtDNA控制区的中央保守区（central conserved domain）识别了保守序列B，C，D，E，F。

Lee等对众多鱼类的序列进15 行比较时，仅识别了CSB-D 的存在。

刘焕章对比哺乳动物和一些鱼类序列，识别了鳑鲏鱼类的CSB-F，CSB-E，CSB-D，并确定了识别它们的关键序列，CSB-F的关键序列为：ATGTAG-TA----GAGACCACC，它是分开终止结合序列区和中央保守区的标志；紧接其后的是CSB-E，CSB-E有较大的变异，识别的标志是关键序列为：AGGG-----GTGGGG 的存在，其中含有GTGGG-box；在CSB-E之后是CSB-D，识别的标志是关键序列为：TATT-CTTG-ATCTG-T-A。

此外，在鲿科鱼类和不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的中央保守区中的CSB-F，CSB-E，CSB-D也被成功识别并找出关键序列，但曾青兰等[15]在大口胭脂鱼（Cyprinellus Valenciennes）中只识别了CSB-D。

保守序列区（conserved sequence blocks）包含有重链的复制起点OH，重链和轻链的启动子（HSP和LSP），以及3个保守区CSB1，CSB2，CSB3，研究表明CSB1 与mtDNA 的复制起始相关。

在已研究线粒体控制区的鱼类中，雅罗鱼（Leuciscus idus），鳑鲏鱼类（Rhodeus lighti），鲿科鱼类（Pelteobagrus）[13]，溪鳉（Aplocheilus lineatus），大口胭脂鱼（Cyprinellus Valenciennes）[14]以及不同倍性鲤科鱼类等的CSB1，CSB2，CSB3 已被成功识别，不同鱼类的CSB的一般形式稍有不同。

其中CSB1最为保守，几乎所有的脊椎动物都含有CSB1，但发现肺鱼只有CSB2和CSB3，鳕鱼只有CSB2。

4 鱼类线粒体DNA控制区的研究意义及其应用4.1 线粒体DNA控制区序列在研究鱼类种内遗传分化中的重要意义鱼类是脊椎动物中较原始而在种属数量上最占优势的一个类群，其分布广泛，起源复杂。

现代鱼类分类系统从鱼类的形态结构、生理特征以及化石资料中探求鱼类的进化历程，取得了很多有意义的结果。

但由于许多客观条件的限制，在研究过程中时常感到证据不足，在种下水平尤为突出。

鱼类mtDNA控制区序列研究技术不仅能对鱼类的多样性进行分类和命名，而且能对产生并维持该多样性的过程进行研究。

Lee等人[15]专门探讨了硬骨鱼类D-Loop的结构和进化方式，发现即使在亲缘关系很近的物种间也存在高度的长度变异。

对于探讨一些快速形成的物种，D-Loop提供的信息可能更有价值。

在剑尾鱼属（Xiphophores）系统关系的研究上，Lockhart等人[16]就认为D-Loop提供的信息更为可靠。

以序列测定技术为支持，鱼类线粒体D-Loop是研究鱼类种内基因分化最常用的工具。

线粒体控制区序列分析在鱼类种内种群结构和遗传分化的研究中具有多方面的重要意义。

目前，己有众多的工作学者将D-Loop作为分子标记应用于鱼类种内鱼类线粒体及线粒体控制区的研究进展遗传分化的研究。

4.2 D-Loop分析为传统鱼类形态学分类提供了分子生物学证据传统的鱼类分类学综合了外形、骨骼、食性以及生活史等各个方面对鱼进行分类，但有些种内的分化特征无法利用传统方法进行进一步的分类。