最新鱼类线粒体DNA的遗传分析研究

研究内容
鱼 类 线 粒 体 DNA
遗传特点 结构特点 提取方法 检测分析 研究进展 应用前景
一、鱼类mtDNA的遗传特点
mtDNA通常为母性遗传,这种传递方式是由于成熟的卵母细胞所含的 mtDNA较精子中的mtDNA高几千倍。该遗传方式便于进行群体分析,只需 少量个体便能反应群体遗传结构。
mtDNA进化主要以碱基替换为主,插入和缺失较少;碱基替换主要发生 在基因间隔区和控制区,且不同部位替换速率不同。
郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类的CSB1(一般形式为:ATTAATTAATG-T-GCAGGACA-TA) ,CSB2(一般形式为:CAAA-CCC CCCTACCCCC) ,CSB3(一般形式为: TGTCAAACCCGAAA CCA)
2、L-链复制起始区
L-链复制起始区(OL)长约30～50bp,位于L-链tRNAAsp和tRNACys 基因间。富含G-C对,而环的碱基组成、长度变异比较大。5′GCCGG-3′是OL中RNA引物与DNA合成的转换区,位于H-链OL 茎区5′端,其序列组成和位置从人、海豹、果蝇到鲤鱼、泥鳅、 虹鳟都是十分保守的。
H链复制起始区：OH
终止结合序列区：TAS
控制区包括
保守序列区：CSB L-链启动子：LSP H-链启动子：HSP
（1）、H链复制起始区：OH
①包含与DNA复制终止相关的序列TAS,拷贝数在l～8个之 间,mtDNA长度鱼中的ETAS 为TACATAT-------ATGTATTATCACCAT-----TATATTAACCA③郭新红等人在研究不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的结构时发现 红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤含有4个TACAT核心序列,日本白鲫中 含有3个TACAT核心序列,三倍体湘云鲤含有1个TACAT核心序列,而 已有报道的斑马鱼中含有6个TACAT核心序列。
（4）、探针法：又称杂交法。将基因组DNA酶切，用mtDNA 探针进行South杂交来识别DNA上的mtDNA谱带，通过自显影 检测印迹。
（5）、PCR-SSCP:是PCR技术和SSCP技术的结合产物经过 变性后进行单链DNA凝胶电泳时每一条单链处于一定的位置,靶 DNA中若发生碱基缺失插入或单个碱基置换时就会出现泳动变 位从而揭示该片段有基因变异的存在 。
线粒体DNA是Nass等在1962 年发现的。之后，1992年台湾 学者Tzeng等发表了台湾缨口 鳅线粒体DNA全序列，这在鱼 类是首次。 截止到2004年已测定161种 鱼类线粒体DNA全序列，它们 的分子量在15.2~19.8Kb之间 。（除海七鳃鳗、淡水七鳃鳗 和溪鳉外,其余158种鱼mtDNA 的结构和基因成分都与其他脊 椎动物的类似
（三）、鱼类mtDNA非编码区各片段基因研究进展
鱼类mtDNA非编码区包含两段,一段是控制区(control region) ,另 一段是L-链复制起始区。 1、mtDNA控制区结构研究：控制区又称D-环区 ,位于tRNAPro和 tRNAPhe基因之间,是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域,但其 中也包含有保守片段。 因此常常作为线粒体mtDNA遗传分析基因片段，例如：朱雪莲 等人借助mtDNA控制区序列分析金鱼与不同地域鲫的亲缘关系。 刘琳等人应用PCR技术对行两性生殖的天津子牙河42尾二倍体野 生鲫鱼群体mtDNA的D-loop区段进行扩增，结果显示：个体间不 存在长度变异现象
六、鱼类mtDNA应用前景
1、群体遗传结构分析 例如：周建峰等运用PCR-RFLP方法分析了鲤鱼3个亚种线粒体 DNA的ND5/ 6区段来了解它们之间的遗传关系,找到了区分鲤鱼3 个亚种的线粒体DNA分子遗传标记 2、类群识别 例如：多态性丰富的 mtDNA可作为类群识别的标志。Barlett 等【 5】利用 Cyt b基因的 307bp 序列，成功地区别了加拿大东海岸的 4 种有重要商业价值的金枪鱼，为保护处于濒危状态的蓝鳍金枪 鱼提供了技术支持。Murakami等分析了 169 尾鲫鱼的 D-loop 序 列，共检出 37 个单倍型，它们构成了 3 个主要的群体，其中白 鲫的两个单倍型自成一个群体，支持了传统形态分类学将白鲫定 位为鲫鱼的一个亚种的论断。
2、ATPase8、ATPase6 刘良国等运用PCR扩增、克隆、测序等技术对五种鲫鱼品系的线粒 体DNA ATPase8、ATPase6的基因序列的碱基组成、变异情况和分子 系统进化进行了比较分析发现红鲫和普通鲫关系较近，洞庭青鲫和彭 泽鲫关系较近，而他们与日本白鲫关系较远，因此推测红鲫、洞庭青 鲫和彭泽鲫均起源于普通鲫。 3、NADH降解酶基因 (1)姚纪花等对我国6个地区银鲫的mtDNA2ND5/ 6片段进行了RFLP 分析,共获得11种图谱和7种限制性类型,根据各群体间的遗传距离构建 了UPGMA聚类关系图,探讨了银鲫6个种群间的遗传关系。
四、鱼类mtDNA的检测分析
目前用于鱼类mtDNA多态性的检测方法主要有以下几种： （1）、内切酶图谱法：一般用双酶消化构建鱼类mtDNA限制酶图 谱。内切酶图谱法是一种较早的研究方法,此法虽在检测点突变上较 为直观,但费时且须做双酶切,其谱带亦较复杂,若个体出现多态就更 难解释。 （2）、标准RFLP：其研究步骤为：mtDNA样品一RE消化一电泳 一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品， 如mtDNA和PCR扩增产物，还可进行位点比较和片段长度比较。 （3）、PCR—RFLP法：从细胞总DNA中，用设计的引物扩增 mtDNA某一序列，RE消化，溴化乙锭染色，电泳检测。这一技术 不仅可直接酶切小于500—2 000 bp的短小片段，还避免了纯化 mtDNA的繁琐工作。
mtDNA进化速率较核DNA快5～10倍,其原因主要有: (1)选择压力小; (2)受诱变的影响大;(3)代谢增补时间短;(4)复制无校对修复
二、鱼类mtDNA的结构特点
1、分子较小且存在长度多态性:鱼类mtDNA分子大小范围一般在 15-19kp之间，约占总DNA的1％。鱼类mtDNA的分子大小在种间存 在差异，但这种长度差异并非源于基因数目，主要由于串联重复 序列的存在。 2、编码效率高:同核DNA相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，基 因间隔常少于10bp,且无内含子，编码效率较高。此外,部分 mtDNA的密码子不同于基因组DNA，且缺少终止密码子，仅以U或 UA结尾。 3、拷贝数多:鱼类每个细胞中有1000—10000个线粒体DNA拷贝， 容易从组织中分离纯化。 4、进化速度快:鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA，为基因组DNA 的5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤修复机制，修复效率低。
鱼类线粒体基因组研究进展
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研究背景
线粒体是存在于绝大多数真核 细胞内的一种基本的重要的细 胞器，它含有自己的DNA，具 有相对独立的遗传系统。它是 细胞进行氧化磷酸化的场所。 线粒体基因组不仅是研究DNA 结构与复制转录的良好模型， 也是研究真核细胞核酸与蛋白 质合成非常合适的模型系统。
鱼类线粒体基因组
（2）、中央保守区
郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的中央保守 区的CSB-F(关键为:ATGTAG----GAG ACCACC) ,CSB-E(关键序 列为:ATG-AT-GAATCA-GGACA-) ,CSB-D(关键序列为:TTATCTGG-ATCTG-T-AA)
（3）、保守序列区
5、解码体系简单:鱼类mtDNA的解码由一个很小的tRNA体系完成，而不像在 核基因组摆动假说中所要求的需要在32个tRNA反密码子上的摆动。 6、遗传的相对独立性:mtDNA能以自身为模板进行复制，能转录生成信使 RNA(mRNA)、转运RNA(tDNA)和核糖体RNA(rRNA),也能编码合成一些维持 自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行 为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和 一些小的RNA，特别是tRNA来实现的 。 7、同质性与异质性:一般情况下，在一种生物机体内仅存在一种类型的mtDNA 分子，但现在大量发现一些个体存在多种类型mtDNA分子，这种特性被称 mtDNA分子的异质性。 8 、多态性:mtDNA中存在多态现象多态性集中在D环，其他区域则高度保守一 。 9、母系遗传:mtDNA一般不发生重组，随细胞质进行。但鳗鱼线粒体为双亲遗 传
（6）、测序法：直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列 。这种方法可获得大量直接可靠的数据。（目前，一般测序公 司采用测序的原理是双脱氧链终止法）
五、鱼类mtDNA研究进展
（一）、鱼类全序列mtDNA研究
曹萤等使用6种酶对尼罗非鲫和奥利亚非鲫的mtDNA进行RFLP分析, 测得两种鱼mtDNA都约为16. 83kb,并认为PvuⅡ可作为鉴别两种鱼类的 限制性内切酶
（二）、鱼类mtDNA编码区各片段的研究
1、细胞色素b(Cyt-b)基因片段
田燚等对六个鲫鱼品系进行了线粒体Cytb基因PCR-RFLP分 析利用5种限制性内切酶对细胞色素b基因进行酶切，结果显示供 检测到4种组合单倍型，野鲫和黑龙睛的遗传距离为0，高背鲫与 彭泽鲫的为0，野鲫与红鲫为0.00039。得到的结果为鲫鱼群体 内的多态性比较贫乏。
（2）庄怡等人采用PCR -RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNA ND3/ND4L /ND4 基因片段，对鲫鱼6个不同品系的基因片段进行测序。首次提出异育 银鲫和浙江地区野鲫（河鲫鱼）在mtDNA ND3/ND4L/ND4 基因上的分子 鉴定法。
4、细胞色素c基因片段 大量研究表明，物种内的COI 基因的序列分歧很少有大于2%的, 大部 分的种内分歧小于1%。程磊等人利用鱼类的DNA条形码研究了线粒体细 胞色素c 氧化酶亚基I ( COI )基因5' 端651 bp 的片段在这些种和亚种（共 计 128 尾标本）中的变异。得到的结论为：金鱼起源于中国南方的鲫而不 是银鲫，以及发现某些单倍型是二倍体与三倍体共享的，所以倍性也不宜 作为种的划分标准, 简单的将三倍体视为独立的种或者亚种并不恰当。
鱼类线粒体DNA基因组结构示意图 （西田，1998）
22个tRNAs
37 个 编 码 基 因
2个rRNA基因：(12SrRNA和16SrRNA)
控制区(D—环区)
细胞色素b(Cyt b) 轻链复制起始区 13 个疏水蛋白基因 2个ATP酶的亚单(ATPase8和ATPase6) 3个细胞色素c(Cyt c)氧化酶的亚单位(COⅠ、Ⅱ和Ⅲ) 7个NADH还原酶复合体的亚单位(ND-1、-2、-3、-4、4L、-5和-6)
3、类群的地理分化 例如：Durand等对62种鲤科鱼的线粒体Cyt b基因的遗传变异进行 分析,阐明中东是淡水鱼种形成的交界地 4、类群的起源分化、扩散 例如：Liu等利用mtDNA控制区序列变异探讨了鲤科鱼的系统发育 关系。
三、鱼类mtDNA的提取方法
（1）直接从鱼类组织提取线粒体DNA 从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体DNA 。其中碱变性法是常见的实 验方法，主要溶液是STE液：10 mmol NaC1，15 mmol Tris-HC1(pH8.0)， 45 mmol EDTA(pH8.0)，0.25 mol蔗糖。把提取的线粒体DNA放入一20℃ 保存备用。该方法获得的是鱼类的整个mtDNA分子。 一般肝细胞、胃壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取 mtDNA获得纯度很高的mtDNA用于研究要选取这些组织，必须杀死鱼才 能得到，研究存在数量多的鱼类可以采用该法。 （2）先提取基因组DNA再用相应引物PCR 扩增所需mtDNA某一区域序 列片段。