茶多酚对大肠杆菌抑菌机理的研究_董璐2015

Email： donglu1006@ 163． com。 通讯作者： 李迎秋， 博士， 教授， 研究方向为食品生物技术，
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生 物 学 杂 志 Vol. 32 No. 1 Feb， 2015 JOUＲNAL OF BIOLOGY
Abstract Tea polyphenols is an active material with broadspectrum antibacterial action． In this paper，Oxford cup experiment was performed to study the minimal inhibitory concentration of TP on E． coli． Crystal violet assay，electrical conductivity test and ion leakage measurement were also performed to determine the effect of TP on cell membrane of E． coli． Agarose gel electrophoresis was carried out to analyze the effect of TP on E． coli DNA． The results was the minimal inhibitory concentration of TP was 40 μg / mL． The value of OD590 increased with the increase of TP concentration． And the value of conductivity and ion leakage increased with the increase of time ，which shown that TP could change cell membrane permeability． DNA of E． coli treated with TP was extracted and compared with blank control group，the band of DNA of experiment group emerged dimmed and trailing，and this result indicated that TP can act on DNA of E． coli． Keywords tea polyphenols； antibacterial activity； antibacterial mechanism； Escherichia coli
Ｒesearch on the antibacterial mechanism of tea polyphenols on Escherichia coli
DONG Lu，DAI Zengying，HAN Qing，LI Yingqiu
（ College of Food and Biological Engineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353 ，China）
收稿日期： 2014 － 08 － 05 ； 修回日期： 2014 － 09 － 01 作者简介： 董 璐， 硕士， 研究方向为食品生物技术；
素（ epigallocatechin ，EGC ） ， 表儿茶素没食子酸酯（ epicatechin gallate，ECG） 和表没食子儿茶素没食子酸酯 （ epigallocatechin gallate，EGCG ） 组 成［13］， 其 中 EGCG 和 ECG 是 TP 中 两 种 主 要 成 分， 含 量 分 别 为 36% 和 ［14 ］ 24% ， 同时也 是 使 TP 具 有 抑 菌 作 用 的 主 要 成 分 。 Yanagawa 等人研究Βιβλιοθήκη BaiduEGCG 对临床分离的对抗生素有抗 性的幽门 螺 旋 菌 的 抑 菌 活 性， 结 果 显 示 MIC90 为 100
生 物 学 杂 志 Vol. 32 No. 1 Feb， 2015 JOUＲNAL OF BIOLOGY
第 32 卷第 1 期 2015 年 2 月
doiʒ10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2015. 01. 072
［13 ］ μg / mL 。Cho 等人研究茶多酚对抗药性金黄色葡萄 TP 对 13 株 MSＲA 的 MIC 为 球菌（ MSＲA） 作用结果为， 8 512 μg / mL， 而当采用 Oxacillin 与 ≤0. 5 倍 MIC 复 ［15 ］ Oxacillin 配时， 的 MIC 降低 8 128 倍 。 Gordon 等 人研究了 EGCG 对嗜麦芽寡养单胞菌的抑菌效果， 当
绿茶是世界上最受欢迎的饮品之一， 由于其中富 TP ） 、 含许多营养物质， 如茶多酚（ tea polyphenols， 维生 ［1 ］ 并且 TP 具有抑菌 、 素和氨基酸等物质 ， 抗氧化 、 抗癌 ［2 － 5 ］ ， 同时还具有减肥降血脂的 和抗龋齿等生理功能 ［6 ］ 功效 。中国已经明确把 TP 作为食品抗氧化剂列入 《GB2760 － 2011 食品添加剂使用标准 》 到 中， 对 TP 的 抗氧化能力的研究已经十分成熟 。近年来， 对 TP 抑菌 活性的研究也日趋成熟 。TP 具有广谱抗菌作用， 它对 ［7 ］ ［8 ］ ［9 － 11 ］ ［1 ］ 肠道致病菌 、 口腔微生物 和孢子 均有 病毒 、 ［12 ］ ， 不同程度的抑制作用 。 TP 占茶叶干重达 15% 主 要由 儿 茶 酸 （ catechin， C ） ， 表 儿 茶 素 （ epicatechin ， EC ） ， 没食子儿茶素（ gallocatechin，GC） ， 表没食子儿茶
茶多酚对大肠杆菌抑菌机理的研究
董 璐，代增英，韩 晴，李迎秋
（ 齐鲁工业大学 食品与生物工程学院 ， 济南 250353 ）
摘 要 茶多酚（ tea polyphenols，TP） 是一种具有广谱抗菌作用的活性质 ， 以大肠杆菌 （ Escherichia coli，E． coli ） 为 研究对象， 采用牛津杯实验研究茶多酚的最小抑菌浓度 ， 并采用结晶紫实验、 电导率测定、 离子泄漏测定来分析 TP TP 对 E． coli 的 对 E． coli 细胞膜通透性的影响 。通过琼脂糖凝胶电泳分析 TP 对 E． coli DNA 的影响。 结果显示， OD590 也随之增大； 随着处理时间的增长 ， 电导率随之 最小抑菌浓度为 40 μg / mL； 结晶紫实验中， 随着浓度的增大， 增大， 离子泄漏随之增多， 说明 TP 可以作用于 E． coli 的细胞膜， 能够改变其通透性。 通过琼脂糖凝胶电泳分析可 DNA 条带出现变暗、 知 TP 处理后和空白对照组相比较 ， 拖尾现象， 说明 TP 能够作用于 E． coli 的遗传物质 DNA。 ； ； ； 关键词 茶多酚 抑菌活性 抑菌机理 大肠杆菌 中图分类号 TS201． 3 文献标识码 A 文章编号 2095 － 1736 （ 2015 ） 01 － 0072 － 04
第 32 卷第 1 期 2015 年 2 月
EGCG 浓度为 256 μg / mL 时， 可杀死 50% 的嗜麦芽寡 ［16 ］ 已有研究者将其应用于水果 、 养单胞菌 。 目前， 海 ［17 － 19 ］ 。 但是对 TP 的抑菌 鲜及肉制品的防腐保鲜方面 机理还不清楚， 有研究报道 TP 可作用于细菌微生物的 ［20 ］ 电导率 磷脂双分子层 。本文实验通过结晶紫实验， 测定， 离子泄漏实验研究 TP 对 E． coli 细胞膜通透性 的影响， 并研究 TP 对 DNA 的作用情况 。 1 材料与方法 1. 1 材料 茶多酚（ ≥98% ） 湖南金农生物股份有限公司； 供 试菌种（ E． coli ） 由作者实验室保藏； 菌种用 LB 培养基 培养。 1. 2 仪器与设备 AL204 电子天平， 瑞士梅特勒 － 托利多仪器有限 公司； MApADA V － 1100 可见光分光光度计， 上海美谱 / LG10 － 2. 4A 达仪器有限公司； 京立 型高速离心机， 北 京京立离心机有限公司； 雷磁电导率仪 ODS － 307 ， 上 DYY － 6C 海精密科学仪器有限公司； 型电泳仪， 北京 六一仪器厂 。 1. 3 方法 1. 3. 1 菌液制备 37 ʎ C 将 E． coli 活化后， 接种于 LB 液体培养基， 8 摇床培养过夜， 使其活菌数达约 10 cfu / mL 备用 。 1. 3. 2 最小抑菌浓度（ MIC） 测定 采用牛津杯法， 用无菌移液器取上述各种菌悬液 0. 5 mL 于平板上， 然后用无菌涂布棒涂布均匀， 待凝 固后将直径为 9 mm、 已杀菌的牛津杯呈正三角形放置 在每个平板上 。采用二倍稀释法将 TP 配成质量浓度 20 、 40 、 80 、 160 、 320 和 640 μg / mL 的水溶液 。 每 为 10 、 个平板其中 2 个牛津杯内加入 TP 溶液， 另一个加入无 菌水作为空白对照 。 每个浓度 TP 重复 3 个平板， 于 37ħ 培养 24 h ， 用透明直尺测量抑菌圈的直径 。 抑菌 圈直径≥10 mm 时认为有抑菌作用 。 1. 3. 3 结晶紫试验 供试菌 E． coli 在 37 ʎC 下于 LB 液体培养基中培 8 养至菌液浓度约为 10 cfu / mL。 取 3 mL 菌液 4500 r / min 离心 15 min ， 得菌体， 用蒸馏水冲洗 3 次后重悬于 3 mL 含 有 不 同 浓 度 TP （ 40 、 80 、 160 、 320 和 640 μg / mL） 的 PBS 缓冲液（ 0. 05 M ， pH 值 7. 0 ） 中， 置于 37ħ 下培养 30 min 。培养结束后 8000 r / min 离心 5 min ， 得 10 g / mL PBS pH 菌体重悬于含有 μ 结晶紫的 缓冲液（ 值 7. 0 ） 中 37 ʎC 下培养 10 min， 之后 12000 r / min 下离 心 15 min ， 收集上清液在 OD590 处使用紫外可见分光光 度计测量吸光度（ 用 0 μg / mL TP 处理的作为对照组调 零） 。 1. 3. 4 电导率测定 通过测定 TP 与 E． coli 作用后电导率的变化研究
TP 对细 菌 细 胞 膜 通 透 性 的 影 响 。 将 待 测 E． coli 在 37ħ 下于 LB 液体培养基中培养， 使其菌落浓度约为 8 10 cfu / mL， 取此菌悬液在转速为 6000 r / min 条件下离 心 15 min 。将得到的菌体重悬于磷酸盐缓冲液（ pH 值 7. 0 ） 缓缓的洗剂 3 次 。 加入不同浓度 （ 40 、 80 和 160 g / mL ） TP μ 相同体积的 的液体， 用无菌水代替 TP 作为 对照组 。然后放在 37 ʎ C 的摇床振荡 （ 150 r / min ） 培 养， 每隔 20 min 取 出 5 mL， 在 6000 r / min 下 离 心 5 min ， 20 、 40 、 60 、 80 、 100 用电导率仪分别测定菌液在 0 、 和 120 min 的电导率值 。 1. 3. 5 离子泄漏的测定 8 将培养至菌液浓度约 10 cfu / mL 的 E． coli 菌悬液 离心， 用无菌水洗涤 3 次， 实验组加入 TP 至终浓度为 4 倍的 MIC ， 以加入相同体积的无菌 水 作 为 对 照 组， 在 37ħ 、 150 r / min 的恒温摇床振荡培养， 每隔 20 min 取 出 5 mL 菌液， 在 6000 r / min 下离心 5 min ， 取上清液进 行消化处理， 然后用原子吸收光谱仪分别检测上清液 + Ca2 + 和 Mg2 + 的浓度变化， 并绘制曲线 。 中K 、 1. 3. 6 TP 对 E． coli DNA 作用 分别将培养至对数期 E． coli 在 3000 r / min 下离 心 15 min ， 收集沉淀进行分组实验 。 对照组 A： 取 10 mg E． coli 菌体悬浮于 PBS 缓冲液， 37 ʎC 保温 6 h 后， 提取 DNA； 实验组 B1 ： 取 10 mg E． coli 菌体沉淀物悬 37 ʎ C 保温 6 h 后提取 DNA； 浮于 80 μg / mL TP 溶液， 实验组 B2 ： 取 10 mg E． coli 菌 体 沉 淀 物 悬 浮 于 160 37 ʎC 保温 6 h 后提取 DNA。 DNA 的 μg / mL TP 溶液， 提取按试剂盒提取步骤进行 。 根据 DNA 的分离范围 选择 1% 的琼脂糖凝胶进行恒压 70 V 电泳， 电泳完成 后用凝胶成像系统进行观察 。 2 结果与分析 2. 1 TP 对 E． coli 的最小抑菌浓度（ MIC ）