02细胞生物学技术(1)

四、细胞培养
用培养细胞所进行的实验，通常称为in vitro （即在玻璃容器中）。
常用的细胞系
细胞系 3T3 BHK-21 HeLa
细胞类型及来源 成纤维细胞(小鼠) 成纤维细胞(叙利亚仓鼠) 上皮细胞(人宫颈癌)
细胞系 PTKl L6 SP2
细胞类型及来源 上皮细胞(袋鼠) 成肌细胞(大鼠) 浆细胞(小鼠)
复型和冷冻蚀刻技术
细胞核 细胞质 小泡
线粒体
质膜
扫描电子显微镜
Scanning electron microscope，SEM
扫描电镜的工作原理
人类红细胞
酵母
人类精子
扫描隧道显微镜（纳米显微镜） scanning tunneling microscope，STM
STM image of a DNA molecule
中国科学院细胞库
五、重组DNA技术
1. 原位杂交技术
用核酸探针确立特殊核苷酸序列在染色体上或在特殊类 型细胞中的位置，这种方法称为原位杂交技术。
LDLR gene
22号染色体
Multicolor Fluorescence in Situ Hybridization (mFISH)
each chromosome is painted in a different color
品干燥后残余染料将沉积在
样品的周围以及样品的凹陷、
空隙处，而样品本身反而呈
经负染的肌动蛋白丝
浅色，故称为负染。
超薄切片技术
复型和冷冻蚀刻技术
负染法和投影法
分离的质粒
投影法是把分散有样品的
载网置于真空罩中，使铂或钯
等重金属受热蒸发。金属颗粒
以一个倾斜角度直进地落到样
品表面。这样，随着样品的起
伏，各处的重金属呈现不同的
蛋白质
3H-亮氨酸
细胞
2）. 放射自显影技术
显微放射自显影图
3）. 利用抗体示踪细胞分子
A. 抗体 + 荧光素 LM(免疫荧光显微镜)
B. 抗体 + 胶体金 EM(免疫电镜)
C.抗体＋酶 ELISA
酶 底物
显色
酶
三、 细胞及其组份的分离和分析
1. 流式细胞术 2. 离心技术 3. 免疫磁珠技术 4.激光俘获显微切割技术 5. 层析技术 6. 电泳技术 7. 质谱技术
R=0.61λ/N.A. （N.A.=n·sinα/2）
物镜的数值孔径
提高显微镜分辨率的方法
• 用短波长的光照射： 如紫外光显微镜，电子显微镜。
• 增大物镜的数值孔径： 在物镜和盖玻片之间充以n较大的油，如香
柏油n=1.52,不仅使n增大，而且孔径角也增大。
1. 光学显微镜
对不同细胞组分进行选择性染色能显示出细胞中 特殊部分如核或膜。
50µ m
用4种不同的光学显微镜技术所观察到的培养中的成纤维细胞
（A）光直接通过细胞所呈的影像 （B）相差显微术
（C）微分干涉差显微术
（D）暗视场显微术
细胞荧光技术
用荧光显微镜可观察细胞中的荧光。细胞荧光 技术在现代生物学中已被广泛应用。
GFP
Brain cells stained with Calcium Green-1, AM . The cells are responding to the neurotransmitter, glutamate, with an increase in cytoplasmic Ca2+ concentration.
• 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、 真空系统、记录系统、电源系统等5部 分构成；
• 分辨率0.2nm，放大倍数达百万倍； • 用于观察超微结构（小于0.2µm）。
制样技术
超薄切片技术 固定技术 负染法和投影法 复型和冷冻蚀刻技术
超薄切片技术
电子的穿透能力很弱， 因此要把样品做成很薄。
最常用的是50纳米左右 的切片，即一个一般大小的 动物细胞要切成300片。用超 薄切片机（ultramicrotome） 制作。
放大镜
显微镜的成像原理
显微镜的几个基本概念
显微镜的几个基本概念
分辨率：能区分两质点的最小距离。 R=0.61λ/ n·sin
(R:分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角) 显微镜能分辨的距离越小，分辨率越高。
光源：能发射光波的物体。 波长范围：390nm – 760nm。 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红
原核细胞
植物核细胞
真核细胞
变形虫
二束光波同相位时，合波振幅增加，亮度增加； 二束光波处于相反相位时，则相互抵消，合波的振幅和亮度降低
波之间的相位关系， 产生同样的干涉效应。例 如，用同一波长的光照射 一个直狭缝，所呈的放大 像是一系列平行线；如照 射一小圆孔，所呈的像是 一系列同心圆。
把一物体放在光源和观察者之间，当光线通 过一固体物的边缘时，在高倍放大情况下所观察 到的干涉效应。
相差显微镜和微分干涉差显微镜
用相差显微镜和微分干涉差显微镜可直接从显微中 观察未经固定和染色的活细胞。
通过活细胞的光的相位 发生了变化，相差和微分干 涉差显微镜可使光相位变化 转变为振幅变化，产生高反 差影像。
暗场显微镜: 照明的光 线直接光线不能进入物镜， 只有散射光进入物镜，这样 就观察到 暗背景中发亮的细 胞结构。
数值孔径：叫物镜的数值孔径。 N·A = n·sin
不同光线的波长
名 称 可见光 波长（nm） 390~760
紫外光 X 射线 α 射线 13~390 0.05~13 0.005~1
电子束 0.1Kv 10Kv 0.123 0.0122
分辨率（R）大小决定于光的波长（λ）、孔径角 （ α）和介质折射率（n）。
NIH 3T3 cells labeled with the green-fluorescent
荧光素(fluorescein)，绿色荧光
四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光 常见荧光分子的激发光与发射光波长范围
激光扫描共聚焦显微术
(Laser scanning confocal microscope, LSCM)
分离纯度：95～99％
4. 激光俘获显微切割技术
5.层析 — 分离蛋白质
(1)分配层析 纸层析 薄层层析
⑵柱层析 — 分离蛋白质
三种层析用的基质
⑶高压液相层析 ( HPLC）
基质粒度小 分辨率高 分离速度快
6.电泳 — 分析蛋白质、核酸
原理
氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有 净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电 场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、 大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为 电泳。
X射线衍射与核磁共振
在原子分辨水平上，发现 分子（其中包括蛋白质）的三 维结构的主要技术是X-射线衍 射。
X-射线衍射图上每个衍射 点的位置与强度反映出晶体中 原子的位置。所以可从衍射图 中推导出大分子的三维（空间） 结构。蛋白质的结晶工作要求 待测的蛋白质样品是非常纯的， 并且要找出得到结晶的适宜条 件。
电泳 — 分析蛋白质、核酸
Western 印迹
基本步骤: (1)SDS-PAGE (2)转膜 (3)抗体反应 一抗孵育 标记二抗孵育 (4)显色
等电聚焦电泳
双向电泳—蛋白质分子量、等电点
7.质谱技术
（2002年获得诺贝尔化学奖）
原理：通过测定样品离子的质/荷比来进行成分和结构分析的方法 应用：蛋白质鉴定
Multicolor Fluorescence in Situ Hybridization (mFISH)
Multicolor (24-color) banding FISH (mBAND FISH): Human chromosome 5 showing (a) merged and (b) pseudocolor bands following high-resolution multicolor banding fluorescence in situ hybridization. Any change in the location of the bands within the chromosomes following irradiation will be detected.
低 速： 1000g l 0min
中 速： 2000g 20min
高 速： 80000g
1h
超高速：150000g
3h
浓度梯度离心
蔗糖浓度是5％到20％
3. 免疫磁珠技术
利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结 合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。
Fe2O3或Fe3O4颗粒 +
单克隆抗体 免疫磁珠
固定技术
负染法和投影法
复型和冷冻蚀刻技术
固定技术
H
戊二醛
化学固定剂:戊二醛和锇酸(四氧化锇)
O
C CH2 CH2
O
O
Os
O
O
锇酸
CH2
C
O
H
包埋剂: 环氧树脂(万能胶)
负染法和投影法
负染法是在将颗粒和纤
维样品分散在具有亲水性支
撑膜的载网上以后，滴加磷
钨酸或醋酸双氧铀等染料，
并随即吸去多余的染液。样
细胞生物学的许多进展，尤其是近年来振奋 人心的发展，都是由于引入新研究方法的结果。
1 显微镜技术 2 细胞培养 3 细胞及其组份的分离和纯化 4 重组DNA技术 5 细胞工程技术
一、显微镜技术
一个典型的动物细胞，直径为10~20µ m，比 人肉眼能见到的最小颗粒还小5倍。
不同显微结构的尺寸
由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖 体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。
1.流式细胞分选术
应用范围
细胞周期分析 细胞分化检测 细胞凋亡的检测 细胞免疫表型的分析 免疫细胞活化的检测 外周血淋巴细胞表型分析 白血病细胞免疫诊断 造血干细胞分析
······
2.超速离心 — 细胞器、大分子
用制备超速离心机可从细胞匀浆的混合物中分 离出细胞的各种组分。
离心级段
图中各个离心级段的典型数值：
细胞生物学的研究方法
一、显微镜技术 1. 光学显微镜 2. 图像处理 3. 电子显微镜 4. 显微操作
二、细胞培养技术 三、细胞组分分析技术 四、基因操作技术 五、细胞工程技术
学习目的与要求
1. 掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。 2. 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。 3. 了解细胞生物学研究方法的进展。
密度，造成一个反映立体形貌
的像。
超薄切片技术
复型和冷冻蚀刻技术
复型和冷冻蚀刻技术
在用重金属倾斜投影后 再用碳垂直喷镀一次，以形 成一层连续的的碳膜，然后 以强力的消化剂将生物材料 腐蚀掉。这样就只剩下一层 可在透射电镜下观察的带有 重金属造成的影像的碳膜， 称为复型膜。
冷冻蚀刻法是将生物 样品在液氮温度(-196℃ ) 下冷冻，然后用刀将其断 开。这时断面通常总是沿 着生物膜的脂质双分子层 之间形成。稍微升高温度， 令样品中的冰在真空中升 华。
Charles Oatley
现代光学显微镜和电子显微镜的分辨范围
2. 电子显微镜
透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道电子显微镜 与电镜相关的技术
透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM
原理
• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电 子束波长与加速电压(通常50~120KV) 的平方根成反比；
激光扫描共焦显微镜
普通光学显微镜
摇蚊的多线染色体
共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像
1932年 E. Ruska和M. Knoll发明第一台透射电镜 （TEM），人类视野进入超微领域 。
M. Knoll
E. Ruska
• 1952年英国工程师Charles Oatley制造出了第一 台扫描电镜（SEM） 。
凸透镜的五种成象规律
物距 (u)
像距(v) 正倒
大小
虚实
u>2f 2f>v>f 倒立 缩小 实像
u=2f v=2f 倒立 等大 实像
2f>u>f v>2f 倒立 放大 实像
u=f
-
-
-
不成 像
f>u v>u 正立 放大 虚像
图示
应用Baidu Nhomakorabea
照相机、摄像机
测焦距 幻灯机、电影放 映机、投影仪 强光聚焦手电筒
二、标记示踪技术
放射性原子能被高灵敏地检测出来
1）. 利用放射性同位素示踪
把放射性前体(例如3H-胸苷、14C-尿苷和3H-
亮氨酸分别是DNA、RNA和蛋白质合成的前体)
加到细胞中，使放射性前体与已存在的前体分
子混合，因为它们原子之间仅是原子核重量不
同，而化学性质相同，这样，细胞就以同样方
式对其产生反应。
X射线衍射与核磁共振
肌红蛋白
一些核原磁子共核振特别是氢原子核具有磁矩或自 旋。自旋沿着强磁场排列(取向)，在电磁辐射 的射频(RF)脉冲作用下，自旋变为失去取向的 激发态。当被激发的H核返回原来的取向状态时，发射 射频辐射，这种RF以波谱来显示和测量。发射的辐射特 性依赖于H核所处的化学环境。如果一个核的激发将受 到与其邻近的其他核的吸收和辐射发射的影响，则可用 一种二维NMR去鉴别不同氨基酸残基中H核的信号，并 可辨别和测量H核互相靠近以至相互影响时所产生的小 的信号位移。通过测量这种信号化学位移的大小就可得 到互相作用的H原子间的距离。