重组表达步骤
重组蛋白的原核表达
实验三重组蛋白的原核表达、亲和层析及免疫印迹分析一、实验内容1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
2．对重组蛋白进行亲和层析，得到纯度较高的融合蛋白。
3．对纯化结果进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并做蛋白质的Western blot鉴定。
二、实验目的和要求1．了解重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的原理和实验方法。
2．掌握亲和层析基本原理和操作过程。
3．掌握蛋白质的免疫印迹分析。
三、实验操作步骤1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
①将在甘油保存的重组蛋白的表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1）取少量分别接种于10ml LA（LB+100mg/L的氨苄青霉素）培养基中，37℃下过夜培养。
②以1：100转接至100mL LA液体培养基中培养至OD 0.5-0.6。
加入0.5mM的IPTG诱导表达，诱导表达温度为18℃，诱导时间为9小时。
③将诱导表达的菌液于10000 rpm离心5 min，收集菌体，-20℃保存。
④将菌体细胞重悬于5mL缓冲液buffer I（20 mmoL/L Tris-HCL pH 8.0，150mmoL/L NaCl）（表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a））或PBS（Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））中。
⑤取0.5ml悬浮液，冰浴条件下进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min。
分别取上清和沉淀，作SDS-PAGE检测，估计可溶性表达比例。
⑥将以上④得到的重悬液在冰浴中进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min，其上清即为蛋白粗提液（BL21（pET-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））或沉淀（BL21（pQE-IL-2））。
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
重组蛋白的表达系统(详细版)
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2.1 常用酵母表达系统(宿主-载体系统)
• 3.1.1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表 • 由达于系遗统传和生理背景清楚而且安全，酿酒酵母是
最早应用于重组蛋白表达的酵母宿主菌。
• 表达菌株：
• INVSC1是酿酒酵母表达系统的常用菌株，它是一
种双倍体营养缺陷细胞株，在缺少组氨酸、亮氨
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体， 其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的 15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无 毒的L-阿拉伯糖，本底表达量低，启动能力 比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最 高效的启动子，pET表达系统即是以它为中 心构建的。T7启动子整理版来ppt 源于λ噬菌体，专一 9
• 当重组蛋白不表达时：
• 如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白
都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，
蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试
更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋
白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，
通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重
组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以
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重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
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一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试白。
• 终止子：
• 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的 作用分为两类，这两类终止子均在终止点 前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以 保护mRNA在核外不被降解，显著延长 mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。 但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶 效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以 供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重 组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只 有一些自身带有翻译起始信号的外源基因 需要终止子。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
重组dna的技术操作流程
重组dna的技术操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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重组蛋白的大量表达
一、原理
1、E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、步骤
1、一活：从-80℃取菌株，50 mL LB+50 uL抗生素（pet32:AMP，pet28:Kana）+50uL菌种（根据菌活性可多加），置于恒温振荡器中（37℃，150 rpm）培养过夜（约12 小时）。
2、二活：1 L LB+1 mL抗生素+50mL菌种，于恒温振荡器上（37℃，200 rpm）培养2小时。
3、取1.5 mL诱导前菌种，标记，加1 mL IPTG至二活后的LB培养基中根据相应条件诱导表达（低温(125rpm)，高温(150rpm)，8h，12h，20h）
4、诱导后取1.5mL菌，12000rpm离心2min，弃上清，加100uL PBS（可根据情况加50uL），吹打均匀(诱导前保留的菌也同样处理)，煮样，跑电泳。
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术是一种利用基因工程技术将编码目的蛋白质的基因插入宿主细胞中，实现重组蛋白质的表达、纯化和应用的技术。
该技术主要涉及以下步骤：
1.目的基因的获取：根据需求设计合成或从天然基因库中提取目的基因。
2.构建基因表达载体：将目的基因插入到表达载体中，形成重组质粒。
表达载体可以是原核或真核生物的质粒或病毒载体。
3.转化或转染宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
转化或转染的方法包括化学法、电穿孔法、噬菌体感染等。
4.重组蛋白质的表达：宿主细胞接受重组质粒后，开始表达目的蛋白质。
表达形式可以是细胞内或细胞外表达，具体取决于目的蛋白质的性质和宿主细胞类型。
5.蛋白质的纯化和鉴定：通过各种纯化技术，如离心、过滤、离子交换、亲和层析等，将重组蛋白质从宿主细胞中分离出来，并进行性质鉴定，包括SDS-PAGE、Westernblot、质谱等技术。
6.蛋白质的功能研究和应用：对重组蛋白质进行生物化学性质和功能的研究，发掘其在医药、农业、工业等领域的应用价值。
总之，蛋白质重组表达技术是现代生物技术领域中非常重要的技术平台之一，可应用于新药研发、疫苗生产、生物材料制备等多个领域。
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达是指将外源基因插入宿主细胞中进行蛋白质的高效表达，常用的表达宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
蛋白质重组表达的过程通常包括以下步骤：
1. 获取目标基因：通过DNA克隆技术，将目标蛋白质的基因序列从源生物中扩增得到。
2.构建表达载体：将目标基因插入到合适的表达载体中。
表达载体通常包括启动子、转录终止子和选择性标记基因等。
3.转化宿主细胞：将表达载体导入宿主细胞中，常用的方法有化学方法、电穿孔法和细胞感染法等。
4.筛选重组细胞：利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的重组细胞。
5.优化表达条件：通过调控培养条件、温度、培养基组分等方法，优化蛋白质表达水平。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、柱层析和电泳等方法，从细胞裂解液中纯化目标蛋白质。
7.蛋白质鉴定和检测：利用酶联免疫吸附测定法、质谱和Western blot等方法，对蛋白质进行鉴定和检测。
通过以上步骤，可以实现外源蛋白质的高效表达和纯化。
重组蛋白的表达
重组蛋白的表达1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）时期，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面阻碍到下游的分离纯化，因此在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的阻碍，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著阻碍下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依靠于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间能够幸免破裂细胞的步骤，同时由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对集合的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的阻碍，关于其中的有些缺点能够通过一定的方法进行克服和幸免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能爱护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破裂表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的开释周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离爱护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的阻碍，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一样具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
单克隆抗体的重组表达
单克隆抗体的重组表达
单克隆抗体的重组表达主要包括以下步骤：
1. 目的基因克隆：将合成的抗体重链和轻链基因克隆至表达载体中，构建成重链表达载体和轻链表达载体。
2. 载体构建：将目的基因克隆至酶切后的载体，构建重组表达载体。
3. 细胞转染：将两个载体一起共转染至细胞中，如HEK293细胞。
4. 抗体表达：在细胞中表达抗体，通常在转染后的几天内收集含有重组抗体的细胞上清。
5. 抗体纯化：使用ProteinG磁珠纯化瞬时转染细胞上清以及小鼠腹水，得到重组表达的抗体。
6. 抗体鉴定：通过酶联免疫吸附法（ELISA）或其他相关方法，对重组表达的抗体进行鉴定和活性检测。
以上步骤是单克隆抗体的重组表达的基本过程，具体的实验操作可能会根据不同的实验需求和条件有所调整。
同时，重组表达单克隆抗体还需要注意实验操作的规范性和安全性，避免交叉污染和实验误差。
重组抗体表达实验操作
重组抗体表达实验操作
重组抗体表达实验操作通常包括以下步骤：
- 设计引物：根据目标基因的序列，设计一对特异性引物。
- PCR扩增：使用PCR技术将目标基因扩增出来。
- 克隆目的基因：将扩增的目的基因连接到载体上，形成重组质粒。
- 转化宿主细胞：将重组质粒转化到宿主细胞中，使其表达出目标蛋白。
- 筛选阳性克隆：通过PCR、酶切等方法筛选出含有目标基因的阳性克隆。
- 提取蛋白质：从阳性克隆中提取目标蛋白质。
- 纯化蛋白质：使用不同的纯化方法(如亲和层析、离子交换层析等)对目标蛋白质进行纯化。
- 鉴定蛋白质：通过Western blotting、ELISA等方法对目标蛋白质进行鉴定。
需要注意的是，在实际操作过程中，需要严格遵守实验室安全规范，避免对环境和人体造成危害。
同时，还需要根据具体情况选择合适的试剂和设备，以确保实验结果的准确性和可靠性。
重组表达步骤
一．CARP质粒的扩增与测序1.CARP带有Flag标记的质粒的扩增（plasmid 载体）试剂配置LB培养基配方1000 ml:胰蛋白胨TRYPTONE 10 g酵母提取物YEAST EXTRACT 5 gNaCl 10 g加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH（200ul）调pH 到7.0,灭菌LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml胰蛋白胨TRYPTONE 2 g酵母提取物YEAST EXTRACT 1 gNaCl 2 gAgarose 琼脂粉 3 g加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH（40ul）调pH 到7.0,灭菌.等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml(200ul)加入氨苄青霉素，混匀，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。
DH5α感受态细胞的制备1、LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。
14-16h2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。
4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。
5、弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；6．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；7．弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；8.200ul分装保存-20摄氏度（-4摄氏度）CARP质粒转化大肠杆菌1、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.3、42℃水浴，2 min；室温，2 min4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃摇菌30 - 45 min5、用200μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。
重组质粒的原核表达
实验九表达质粒的构建与诱导表达第一节原核表达概述基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。
表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。
也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。
外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约：1．正确的阅读框架为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。
阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。
2．目的基因有效转录的启动子启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为一35区和一10区。
一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。
此两序列之间的最佳间距为17 bp。
可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。
原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。
目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受la cⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp 等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp 启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG 存在时就能够启动转录；噬菌体的λP L、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。
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一．CARP质粒的扩增与测序
1.CARP带有Flag标记的质粒的扩增（plasmid 载体）
试剂配置
LB培养基配方1000 ml:
胰蛋白胨TRYPTONE 10 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 5 g
NaCl 10 g
加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH（200ul）调pH 到7.0,灭菌
LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml
胰蛋白胨TRYPTONE 2 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 1 g
NaCl 2 g
Agarose 琼脂粉 3 g
加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH（40ul）调pH 到7.0,灭菌.
等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml(200ul)加入氨苄青霉素，混匀，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。
DH5α感受态细胞的制备
1、LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。
14-16h
2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇
3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。
4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。
5、弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
6．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
7．弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
8.200ul分装保存-20摄氏度（-4摄氏度）
CARP质粒转化大肠杆菌
1、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.
3、42℃水浴，2 min；室温，2 min
4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃摇菌30 - 45 min
5、用200μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。
（常用的大肠杆菌有BL21和DH5a，前者是表达菌，主要用来表达蛋白，后者是克隆菌，主要用来扩增质粒）
2.将菌液送到公司测序
二．根据CARP的序列设计引物
1.设计引物（引物一端有质粒的酶切位点的基因）
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
2.引物与CARP质粒在PCR后得到含有引物的DNA片段，PCR产物纯化
1. DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶（2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
2．将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
电泳胶回收或者试剂盒回收
PCR产物纯化
1、加5倍体积的PB
2、将Spin柱放于2ml收集管上
3、加样液，14Krpm，离心1min
4、弃去排出液
5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
6、弃去排出液,14Krpm,离心1min
7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
2.DNA片段插入载体，构建重组质粒
双酶切
载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：载体10ul PCR产物20ul
10x buffer 3ul 10x buffer 3ul
100xBSA 0.3ul 100xBSA 0.3ul
酶1 1ul 酶1 1ul
酶2 1ul 酶2 1ul
H2O 14.7ul H2O 4.7ul
双酶切后的载体用试剂盒割胶回收
1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解
3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中
4.加样液，14Krpm，离心1min
5.弃去排出液
6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
7.弃去排出液,14Krpm,离心1min
8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
3.质粒转化BL-21菌中表达
连接
上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。
连接体系如下：
载体 2ul
PCR 片段 6ul
10x酶 buffer 1ul
连接酶DNA ligase 1ul
转化
取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。
将平板在37℃倒置培养过夜。
挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。
4.重组质粒表达产物
生出菌
枪头取菌 +10毫升培养液
摇菌13-14小时 250转 37℃
5.送到公司得单克隆抗体。