《细胞工程》第4章(2)：动物细胞培养工程52
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
《细胞工程》动物细胞培养工程PPT精选文档共126页
END《细胞工程》动物细来自培养工程PPT 精选文档41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
《细胞工程》第4章：动物细胞培养工程
4．2 生产用动物细胞系
4．2．1 生产用动物细胞发展： 生产用动物细胞——是指按生产条件
选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生 物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍 体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的 历史演化。
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
4．2．2 生产用动物细胞的来源
中国，实验室规模
美国，产业 化规模生产 蛋白质公司
流加工艺：产量高易放大、操作简单， 如Genentech、IDEC、 MedImmune、 Merk公司，
连续灌注工艺：适合不稳定产品、 培养利用低、操作复杂、 产品回收大，如：Genzyme、 Genetic Institute、 Bayer公司
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
4．1．2 发展历程：
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
4．1．3 动物细胞培养的特点与方法：
A、动物细胞培养的主要特点 动物细胞对营养要求高 ——血清来源受限，质量不稳，研发无
血清培养液； 动物细胞对培养环境适应性差 —— 生长慢，时间长，生长用动物细胞
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
《细胞工程》第4章：动物细胞培 养工程
4．1 概述
4．1．1 定义：
动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动 物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生 物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特 性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三 部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术 （过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规 模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的 关键技术。
细 胞 工 Cell Engineering 程
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的定义和范围动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作以及细胞和组织培养技术，以改造细胞、创造新的生物品种或生产生物产品的一门综合性科学技术。
其范围涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、细胞重组、转基因动物等多个方面。
二、动物细胞培养技术（一）基本原理细胞培养是动物细胞工程的基础，其原理是细胞具有分裂和生长的能力。
在适宜的条件下，细胞可以不断增殖并保持一定的生理特性。
（二）培养条件1、无菌环境：防止微生物污染是细胞培养成功的关键。
2、合适的培养基：包含细胞生长所需的营养物质，如氨基酸、维生素、无机盐等。
3、适宜的温度和 pH：一般来说，培养温度在 37℃左右，pH 在 72 74 之间。
4、气体环境：通常需要 95%的空气和 5%的二氧化碳，二氧化碳用于维持培养基的 pH 稳定。
（三）培养过程1、取材：从动物体内取出组织或器官，进行处理以获得单细胞。
2、原代培养：将获得的细胞直接培养，这是细胞培养的第一代。
3、传代培养：当原代培养的细胞生长到一定密度时，进行分瓶培养。
（四）应用1、生物制品的生产，如疫苗、抗体等。
2、细胞生物学和分子生物学的研究。
3、药物筛选和毒性测试。
三、细胞融合技术（一）原理细胞融合是指两个或多个细胞通过物理、化学或生物方法融合成一个杂种细胞的过程。
其原理基于细胞膜的流动性。
（二）方法1、病毒诱导融合：使用某些病毒，如仙台病毒，促使细胞膜融合。
2、化学诱导融合：常用的化学试剂有聚乙二醇（PEG）。
3、电融合：通过电场作用使细胞排列紧密接触，进而融合。
（三）应用1、单克隆抗体的制备：将免疫小鼠的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，分泌单克隆抗体。
2、细胞遗传和细胞免疫的研究。
四、细胞核移植技术（一）原理细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，使其发育成一个新的个体。
这基于细胞核的全能性，即细胞核包含了生物体发育所需的全部遗传信息。
动物细胞工程教案
动物细胞工程教案一、教学目标1. 了解动物细胞工程的基本概念和原理。
2. 掌握动物细胞培养的基本步骤和操作技术。
3. 了解动物细胞融合的方法和应用。
4. 理解动物细胞工程在生物技术和医学领域的应用。
二、教学内容1. 动物细胞工程的定义和原理解释动物细胞工程的概念介绍动物细胞工程的基本原理2. 动物细胞培养的基本步骤动物细胞培养的流程和操作方法培养基的选择和配制细胞的分离和培养3. 动物细胞融合的方法介绍动物细胞融合的原理和方法细胞融合技术的应用和意义4. 动物细胞工程的应用动物细胞工程在生物技术领域的应用动物细胞工程在医学领域的应用三、教学方法1. 讲授法讲解动物细胞工程的基本概念和原理介绍动物细胞培养的基本步骤和操作技术2. 实验法进行动物细胞培养实验展示细胞融合技术的实验操作3. 案例分析法分析动物细胞工程在实际应用中的案例讨论动物细胞工程的优势和局限性四、教学评价1. 课堂参与度学生参与课堂讨论和问题解答的情况2. 实验报告评估学生在动物细胞培养实验中的操作技能和结果分析3. 小组讨论评估学生在案例分析中的思考和团队合作能力五、教学资源1. 教材和参考书籍《动物细胞工程》教材或其他相关书籍2. 实验材料和设备动物细胞培养实验室设备和材料3. 多媒体教学资源教学PPT、视频资料等相关教学资源六、教学步骤1. 引入：通过展示动物细胞工程的实际应用案例，引起学生对动物细胞工程的兴趣和好奇心。
2. 讲解：详细讲解动物细胞工程的基本概念、原理和基本步骤，包括动物细胞培养和细胞融合技术。
3. 演示：进行动物细胞培养实验，展示细胞融合技术的实验操作，让学生直观地了解动物细胞工程的技术过程。
4. 实践：学生分组进行实验操作，亲身体验动物细胞培养和细胞融合技术，培养学生的实践能力。
5. 讨论：组织学生进行小组讨论，分析动物细胞工程在实际应用中的案例，探讨动物细胞工程的优势和局限性。
七、教学安排1. 课时：本课程共计15课时，包括9课时理论教学和6课时实验教学。
《动物细胞工程》课件
1
2
3
利用动物细胞工程可以将外源基因导入动物细胞，培育出转基因动物，提高其生产性能和抗病能力。
转基因技术
动物细胞工程可用于生产疫苗，通过培养动物细胞并表达病毒抗原，制备出高效、安全的动物疫苗。
动物疫苗
动物细胞工程可以用于构建生物反应器，通过大规模培养动物细胞生产各类蛋白质和生物活性物质。
生物反应器
选择适当的细胞
通过物理、化学或生物方法诱导细胞融合。常用的物理方法有电融合和激光融合，化学方法有聚乙二醇（PEG）诱导融合，生物方法有病毒诱导融合。
诱导细胞融合
通过特定的筛选和鉴定方法，从大量细胞中筛选出融合细胞，并进行鉴定。常用的筛选和鉴定方法有荧光染色法、免疫学检测法和分子生物学检测法等。
筛选和鉴定融合细胞
技术难度大
动物细胞工程的实施需要高超的技术水平和精细的操作技巧，如何提高技术成熟度和降低成本是亟待解决的问题。
伦理和法律问题
动物细胞工程的实践涉及到伦理和法律问题，如人道关怀、动物权益保护等，需要在实践中严格遵守相关法规和伦理准则。
安全性和有效性问题
动物细胞工程产品的安全性和有效性需要经过严格的评估和验证，以确保其不会对人类健康和生态环境造成不良影响。
1970年代
随着技术的不断进步和应用领域的拓展，动物细胞工程在医学、农业、工业等领域得到广泛应用。
1990年代至今
02
动物细胞培养技术
细胞具有增殖和分化的能力
动物细胞具有自我复制和分化的能力，可以在适宜的环境下生长和繁殖。
03
动物细胞融合技术
选择要进行融合的细胞，通常选择同种或同种的细胞进行融合。
感谢观看
THANKS
基因转移技术
02
人教版教学教案【人教版】10-11学年高二生物(选修)学案——第四章第二节学案动物细胞工程
选修本第15课时 动物细胞工程淮安中学 陈同林知识精讲一、动物细胞工程常用技术——动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等； 技术是其他动物细胞工程技术的基础。
二、动物细胞培养1．过程： 2．应用：① 大规模的生产重要价值的蛋白质生物制品 ② 烧伤病人植皮③ 培养的动物细胞用于检测有害物质④ 培养正常或病变细胞由于科研（如海拉细胞系）三、动物细胞融合1、 动物细胞融合相当于植物体细胞杂交的 过程。
2、动物细胞融合与植物细胞融合的基本原理 同，诱导融合的方法基本相似，只是除 法、 法外，还用到 方法——以 作为诱导剂。
四、单克隆抗体概念：用单个B 淋巴细胞进行 ，也就是通过 ，形成 ，这样的 就可能产生出化学性质 、 的抗体——单克隆抗体。
制备：将免疫B 淋巴细胞与骨髓瘤进行细胞融合，经过 后得到 细胞。
这种细胞经过 后能产生特定 。
将这样的细胞群在 条件下或注射到 内增殖，这样就可以获得大量的单克隆抗体了。
应用：① 疾病诊断、治疗、预防，与常规抗体相比特异性强、灵敏度高；② 治疗癌症——“生物导弹”。
题例领悟例1．动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是Ａ．诱导融合的方法完全相同 Ｂ．所用的技术手段完全相同Ｃ．所采用的原理完全相同 Ｄ．都能形成杂种细胞解析：原理不同，方法和技术手段基本相同，但不完全相同。
答案：D例2．下图可表示细胞融合技术的一些过程，请巨图回答：（1）若A 、B 细胞为动物细胞，从A 和B 细胞到C 细胞的过程中，常用 作为 来诱导融合。
（2）若A 、B 细胞为植物细胞，那么这样的细胞已经用酶降解脱掉了 。
这种酶可能是 酶，由此生成的A 和B 细胞称为 。
（3）若A 细胞为骨髓瘤细胞，B 细胞为B 淋巴细胞，那么D 细胞称为 细胞。
由D 细胞连续分裂产生大量细胞的过程，称为 过程。
这种细胞既能无限繁殖，又能产生 。
解析：略。
答案：（1）灭活的病毒 诱导剂 （2） 细胞壁 纤维素 原生质体（3）杂交瘤细胞 细胞培养 单克隆抗体 C 细胞D细胞A 细胞B 细胞自我评价一、选择题1．用动物细胞培养技术使细胞传到50代以后仍能传下的传代细胞称为Ａ．原代细胞 Ｂ．传代细胞 Ｃ．细胞系 Ｄ．细胞株2．不能人工诱导原生质体融合的方法是Ａ．振动 Ｂ．刺激 Ｃ．PEG 试剂 Ｄ．重压3．下列细胞中，不具有细胞全能性特点的细胞是Ａ．心肌细胞 Ｂ．神经细胞 Ｃ．根的皮层细胞 Ｄ．木质部导管细胞4．动物细胞融合技术最重要的用途是Ａ．培养多倍体的经济动物 Ｂ．培养具有双亲优良性状的经济动物Ｃ．制备单克隆抗体 Ｄ．A 、B 两项5．关于单克隆抗体不正确的是Ａ．化学性质单一 Ｂ．用有性繁殖获得Ｃ．特异性强 Ｄ．可用于治病、防病6．能提高良种家畜繁殖能力的细胞工程技术是Ａ．组织培养 Ｂ．细胞融合 Ｃ．胚胎移植 Ｄ．细胞核移植7．在动物细胞培养中，所培养的动物细胞大都取自Ａ．幼龄动物器官 Ｂ．老龄动物器官Ｃ．中年动物器官 Ｄ．中年动物器官二、非选择题8．如图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌实验方案。
高三生物一轮复习动物细胞工程(4)
领域发挥大作用。
5.诱导多能干细胞（iPS细胞） （1）胚胎干细胞的局限性： 胚胎干细胞必须从_胚__胎__中获取 ，涉及_伦_理__问__题__,因而限制了在医学上的应用。
（2）诱导多能干细胞概念： 通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导
细胞株 从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质
没有发生变化。
细胞系 传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去
接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。
区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制， 容易传代培养。
三、干细胞培养及其应用
动物细胞培养
动物细胞 动物细胞融合技术与单克隆抗体
工程
动物细胞核移植技术
克隆动物
一、动物细胞培养
1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适 宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培
养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。
上皮细胞
肌细胞
神经细胞
4.干细胞的应用 （1）应用原理：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、 器官的发育、再生和修复等密切相关。 （2）应用实例： 造血干细胞：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的 造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕 金森病、阿尔茨海默病等）
多能干细胞，简称iPS细胞。
诱导方法：①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、 B细胞均可）；
《细胞工程》课程说明书
[4] http://61.187.179.69/ec2006/C217/kcms-1.htm
四、教学信息
教学目标
通过本课程的学习使学生掌握细胞工程的基本操作技术、原理及研究对象的特点，为从事生物学相关领域的研究奠定良好的基础。
扩展专题2:科研论文介绍-研读及撰写（2学时）
第17周
课程总结、扩展与答疑（2学时）
答疑
教学方法
与手段
通过教材进行基本内容讲授，多媒体辅助，小组讨论等教学手段相结合。
学习方法
课上听讲，要点分析，分组讨论，课堂小结，课后复习、浏览教学网站、去开放实验室实践。
五、实践教学（独立设课另安排）
六、成绩考核
平时成绩
思考与作业练习见课件
第3周
第3章植物组织与器官培养（4学时）
3.1植物组织培养（2学时）
3.2植物胚胎培养
3.3毛状根培养（2学时）
思考与作业练习见课件
第4周
第4章人工种子与植物脱毒（2学时）
4.1人工种子
4.2植物脱毒
第5周
第5章植物细胞培养与次级代谢产物制备（2学时）
第6章原生质体培养与诱变（2学时）
第6周
第7章细胞融合与体细胞杂交（4学时）
7.1细胞融合（2学时）
第7周
7.2体细胞杂交（2学时）
第8章多倍体与单倍பைடு நூலகம்植物（4学时）
8.1多倍体植物（2学时）
思考与作业练习见课件
第8周
8.2单倍体与纯合二倍体植物（2学时）
视频文献拓展等参考课件
第9周
劳动周
第10周
第9章植物离体受精（2学时）
安立国第二版动物细胞工程思考题参考答案
哺乳动物的克隆方法：胚胎干细胞核移植、胚胎细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。
第一章绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转基因家畜；G. 保护濒危动物。
2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。
第二章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
细胞工程(动物部分)
绪论1.细胞培养与组织培养：属于体外培养，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增值。
细胞的离体培养称为细胞培养，组织的离体培养称为组织培养。
2.细胞融合：又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
3.细胞核移植：是利用显微镜操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂合细胞的过程。
4.干细胞：是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。
5.转基因动物：是通过基因工程技术将外源的目的基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
第一章1.细胞工程实验室与其他一般实验室的区别：要求保持严格无菌环境、避免微生物及其他有害因素的影响。
2.细胞工程能进行的六方面工作：无菌操作、培养、制作、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
3.植物细胞工程实验室特殊的设置：光照条件的培养箱、试管苗需要温室和移植驯化室。
4.细胞工程实验室通用的仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、电热干燥箱、水纯化装置、低温装置、高压蒸汽消毒器。
5.实验室的生物安全分为p1，p2 ，p3 和p4四个生物安全等级，其中P4生物安全实验室等级最高。
第二章1.清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。
2.细胞培养过程中主要使用两类消毒方法:物理灭菌法法和化学消毒法。
物理法灭菌法：a.紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒。
紫外线照射工作台面的距离不应超过1.5cm,照射时间以30min左右为宜。
（注意：紫外灯关闭5min后方可进入使用）b. 湿热消毒:适用于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，为121.3℃，20min .（注意点：加足水、排尽气、气压降到0时才能打开盖）c.干热消毒法:适用于消毒玻璃仪器，160℃以上，并保持90~120min，以杀死细菌和芽孢 d.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤,薄膜0.22~0.45um直径。
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●生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响：
传质系数（KL）——受氧在培养液中的扩散速度影响， 气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系， 鼓泡式 小气泡（<2.5mm）传质系数与扩散系数的 反应器 2/3次方成正比， 大气泡（>2.5mm）传质系数与扩散系数的 1/2次方成正比。 传质比表面积（A）——与通气量成正比，而与气泡直径 的三次方成反比，如增加气量、 减少气泡直径，会提高细胞死亡率 实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对 传质要求的前提下，减少细胞破损。
生 物 反 应 器
生 物 反 应 器 的 操 作
生 物 反 应 器 的 监 控 系 统
生 物 反 应 器 连 接 和 排 流 管 道
低 温 调 整 离 心 机
系 统 控 制 面 板
国产生物反应器及操作
C、无血清流加培养工艺
【习题】
1、概述肝癌单抗片段Hab18F(ab’)2无血 清流加培养工艺技术流程？
●悬浮培养 的驯化 贴壁生长转化为悬浮生长的驯化
B、贴壁培养 （anchorage-dependent culture）
——是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养 方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如 CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较 长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培 养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。 ● 优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高， 产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高；
● 防止细胞机械破裂的培养液成分——
4．4 动物细胞培养工艺
●动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； ● 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同； ●动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。
4．4．1 动物细胞培养工艺基础
实验室规模（laboratory scale） A 、工艺实验研修阶段 中试规模（pilot scale） 生产规模（production scale） 实验室设施 B、实验室管理 ——选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规） D、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装 无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒
●用重组技术或细胞融合技术建立的工程 细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度 培养时，都需经过一定时间的细胞适应能 力驯化； ●细胞对无血清培养条件的适应能力和生 长形式的驯化，对于建立优化的无血清高 密度培养工艺非常重要；
●通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群 体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能 特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基 因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；
B、主要设备
1L悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞 （磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续 旋转过滤器，其它全控） 5L细胞发酵罐（德国，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养 30L细胞发酵罐BiostatRC20（德国，BraunBiotech） （冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大
4．3．3 动物细胞培养的操作方式
4．4．4 培养过程的监测与控制
4．4．5 动物细胞培养工艺
4．4．6 工艺的选择与设计
（反应器投入占整个部分50%）
B
、 生 产 工 艺 的 设 计 原 则
4．4．7 杂交瘤细胞大规模培养制备 抗体的工艺
A、工艺流程图
——肝癌单抗片段Hab18F（ab/）2体外制备工艺
B、具体关系：
● 动物细胞对培养环境传质和混合的要求 对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环 境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要 因素是细胞生长对氧的要求； 反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2· ）≥qO2· C，其中， min KL——液体一侧氧传质系数，A——气液比表面积， qO2——单位细胞耗速率，C——细胞密度， C*O2——液体中氧的饱和浓度，CO2· ——液体中最低氧浓度。 min 一般而言， 提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾 胞操作速率
4．4．2 动物细胞培养方法
原代细胞 ●依细胞来源，可分 传代细胞培养 液体培养 ●依培养液种类不同，可分 固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养 ●依反应器类型和操 中空纤维培养 作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养 ●依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）
Cell Engineering
细 胞 工 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
通气搅拌 生物反应器
传质系数（KL）——氧传质系数仍与扩散 系数的2/3次方成正比，但流体主体 的湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献
气液传质比表面积（A）——气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气 量有关
强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化）
● 决定动物细胞剪切敏感性的因素： 不同细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切 敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞； 细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力； 细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。 ● 微载体细胞培养系统中的细胞损伤——微载体湍流涡旋 相互作用是主要因素； ● 悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤——鼓泡式、气升 式相对温和，决定于气泡聚并与破裂速率；
A、悬浮培养 （suspension culture）：
——是指细胞自由地悬浮于培养液内生长 增殖的一种培养方法；适用于悬浮培养的 生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0， NSO），不适用于正常细胞培养。此种方 法操作简便，传质和传质比较好，易放大， 条件均一；但需产物截流。1996-2000年， 美国，FDA批准70%重组治疗药物。
4．3．5 培养环境与生物反应器
A、原因 ● 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环 境的控制，而生物反应器提供的培养环境 能否满足需要，直接与反应器的型式、操 作状态有关； ● 为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均 一的培养环境，必须使反应器的保持一定 的混合水平和通气条件；
● 动物细胞较大、无壁，它对流体作 用力敏感（剪切敏感性），易损，所 以，反应器的设计、放大和操作过程 必须解决供氧混合与细胞损伤间的矛 盾； ● 必须了解生物反应器的传质与混合 特性、培养环境液体力学现象对动物 细胞生长、代谢及细胞操作的影响；