最新《细胞工程》第4章3：动物细胞培养工程4
动物细胞工程优秀版
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伴随年岁叠加，咱们会渐渐发觉：越是有智慧人，越是谦虚，因为昂头只是稗子，低头才是稻子；越是富有人，越是高贵，因为真正富裕是灵魂上高贵以及精神世界富足； 越是优异人，越是努力，因为优异从来不是与生俱来，从来不是一蹴而就。伴随沧桑累积，咱们也会慢慢知道：成功路，其实并不拥挤，因为能够坚持到底人实在太少； 全部优异人，其实就是活得很努力人，所谓胜利，其实最终就是本身价值观胜利。人到中年，突然间醒悟许多，总算明白：人生，只有将世间路一一走遍，才能到尽头； 生活，只有将尘世况味种种尝遍，才能熬出头。这世间，从来没有最好，只有更加好。天天，总想要努力醒得比太阳还早，因为总以为世间万物，太阳是最能赐人力量和 能量。每当面对喷薄日出，心中太阳随之冉冉腾起，生命之火熊熊燃烧，生活热情就会光芒四射。我真难以想象，那些从来不早起人，一生到底能够看到几回日升？那些 从来没有良好习惯人，活到最终到底该是多么遗憾与愧疚？曾国藩说：早晨不起，误一天事；幼时不学，误一生事。尼采也说：每一个不曾起舞日子，都是对生命辜负。 光阴易逝，岂容我待？越是努力人，越是没有时间埋怨，越是没有工夫颓丧。每当走在拂晓曙光里，看到那些兢兢业业清洁城市“美容师”，我就会由衷地观赏并在心底 赞叹他们，因为他们活得很努力很认真。每当看见那些奔跑在朝霞绚烂里晨练者，我就会从心里为他们竖起大拇指，因为他们给自己力量同时，也赠予他人能量。我总以 为：你能够不优异，但你必须有认真态度；你能够不成功，但你必须努力。这个世界上，从来没有谁比谁更优异，只有谁比谁更努力。我也一直认为：一个活得很努力人， 自带光芒万丈；一个人认真样子，比任何时候都要美好；一个能够自律自控人，他人生也就成功了大半。世间每一个好，从来都只为知道努力人盛装而来。有时候，我真 感觉，人生另一个名字应该叫做努力，努力了就会无悔，努力了就会无愧；生活另一个说法应该叫做煎熬，熬过了漫漫黑夜，天就亮了，熬过了萧萧冬日，春天就来了。 人生不易，越努力越幸运；余生不长，越珍惜越精彩。人生，是一本太仓促书，越认真越深刻；生命，是一条无名河，越往前越深邃。愿你不要为已逝年华叹息，不要为 前路茫茫而裹足不前愿你相信全部坚持总能奏响拂晓号角，全部努力总能孕育硕果盛驾光临。愿你坚信越是成功人越是不允许自己颓废散漫，越是优异人越是努力……生 活中很多时候，咱们碰到一些复杂情况，会很轻易被眼前障碍所蒙蔽，找不到处理问题方法。这时候，假如能从当前环境脱离出来，从一个新角度去处理问题，可能就会 柳暗花明。一个土豪，每次出门都担心家中被盗，想买只狼狗栓门前护院，但又不想雇人喂狗浪费银两。苦思良久后终得一法：每次出门前把WiFi修改成无密码，然后放 心出门每次回来都能看到十几个人捧着手机蹲在自家门口，从此无忧。护院，未必一定要养狗换个角度想问题，结果大不一样。一位大爷到菜市场买菜，挑了3个西红柿 到到秤盘，摊主秤了下：“一斤半3块7。”大爷：“做汤不用那么多。”去掉了最大西红柿。摊主:“一斤二两，3块。”正当身边人想提醒大爷注意秤时，大爷从容掏出 了七毛钱，拿起刚才去掉那个大西红柿，潇洒地换种算法，独辟蹊径，你会发觉处理问题另一个方法。生活中，咱们尤其轻易陷入非A即B思维死角，但其实，遭遇两难困 境时换个角度思索，可能就会明白：路旁边还有路。一个鱼塘新开张，钓费100块。钓了一整天没钓到鱼，老板说凡是没钓到就送一只鸡。很多人都去了，回来时候每人 拎着一只鸡，大家都很高兴！以为老板很够意思。以后，钓鱼场看门大爷告诉大家，老板原来就是个养鸡专业户，这鱼塘原来就没鱼。巧妙去库存，还让用户心甘情愿买 单。新时代，做营销，必须打破传统思维。孩子不愿意做父亲留课外作业，于是父亲灵机一动说：儿子，我来做作业，你来检验怎样？孩子高兴答应了，而且把父亲“作 业”认真检验了一遍，还列出算式给父亲讲解了一遍不过他可能怎么也不明白为何父亲全部作业都做错了。巧妙转换角色，后退一步，有时候是另一个前进。一个博士群 里有些人提问：一滴水从很高很高地方自由落体下来，砸到人会不会砸伤？或砸死？群里一下就热闹起来，各种公式，各种假设，各种阻力，重力，加速度计算，足足讨 论了近一个小时 以后，一个不小心进错群人默默问了一句：你们没有淋过雨吗 大家经常轻易被日常思维所禁锢，而忘却了最简单也是最直接路有两个年轻人，大学毕业
《细胞工程》第4章动物细胞培养工程4
美国，产业 化规模生产 蛋白质公司
中国 批式培养 （batch） 流加培养 （fed batch） 2-100L 中试规模 5-500L 中试规模 5-30L 中试规模
美国 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器
灌注培养 （perfusion）
● 防止细胞机械破裂的培养液成分——
4．4 动物细胞培养工艺
●动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； ● 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同； ●动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。
D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；（10000L规模、g/L级）
E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决： 去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用
4．2 生产用动物细胞系
4．2．1 生产用动物细胞发展： 生产用动物细胞——是指按生产条件 选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生 物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍 体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的 历史演化。
4．3 培养液 与培养 环境
4． 3 ． 1 动物细胞 培养条件
4．3．2 动物细胞培养液和添加剂
4．3．3 无血清无蛋白培养
优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程； 缺点：比较贵，针对性强。
细胞工程实验-动物细胞传代培养
实验四动物细胞传代培养一、实验目的1.掌握消化法细胞传代培养的原理。
2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。
3.学习细胞传代培养操作。
二、实验原理动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。
这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。
80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。
消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。
三、主要仪器与试剂1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞四、实验步骤1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。
2. 从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入，轻摇后倒掉。
3.再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。
4.加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。
5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。
6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。
7.在瓶壁上做标记。
8. 将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。
五、实验结果细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖六、思考题1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。
（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。
《动物细胞工程》细胞工程揭秘
《动物细胞工程》细胞工程揭秘在当今生物科学的前沿领域，动物细胞工程无疑是一颗璀璨的明星。
它宛如一把神奇的钥匙，为人类打开了探索生命奥秘和解决诸多现实问题的大门。
那么，什么是动物细胞工程呢？简单来说，动物细胞工程是以动物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖、改造和应用的一门技术。
这门技术涵盖了多个方面，包括细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植等等。
细胞培养是动物细胞工程的基础。
想象一下，在一个无菌、恒温、营养充足的环境中，让细胞能够茁壮成长，如同在一个精心打造的“细胞乐园”里。
科学家们会根据不同细胞的特点，为它们调配出专属的“营养液”，提供最适宜的生长条件。
通过细胞培养，我们可以获得大量的细胞，用于各种研究和应用。
比如，生产疫苗、研究细胞的生理特性和疾病机制。
细胞融合则是让不同类型的细胞“携手合作”。
就好像把两个不同的拼图块拼接在一起，形成一个全新的、具有特殊功能的“拼图”。
通过细胞融合技术，我们可以将具有不同优点的细胞组合在一起，创造出具有更强大功能的细胞。
比如，将产生抗体的淋巴细胞和能够无限增殖的骨髓瘤细胞融合，得到既能产生抗体又能大量繁殖的杂交瘤细胞，用于制备单克隆抗体。
细胞核移植更是一项令人惊叹的技术。
它就像是给细胞进行一场“换芯手术”。
将一个细胞的细胞核取出，植入到另一个去核的细胞中，从而改变细胞的遗传特性。
最著名的例子就是克隆羊多利的诞生。
多利的出现让人们对生命的复制和遗传的操控有了全新的认识。
胚胎移植也是动物细胞工程的重要组成部分。
它就像是一场精心安排的“生命接力赛”。
将在体外培养好的胚胎，移植到雌性动物的子宫内，让其继续发育。
这项技术在畜牧业中有着广泛的应用，可以大大提高优良品种的繁殖效率。
动物细胞工程的应用领域十分广泛。
在医学领域，它为疾病的诊断和治疗带来了新的希望。
通过细胞工程技术生产的单克隆抗体，可以精准地识别和结合病变细胞，用于疾病的诊断和治疗。
例如，在癌症治疗中，单克隆抗体可以特异性地靶向肿瘤细胞，将药物准确地输送到病变部位，提高治疗效果，减少副作用。
4细胞工程(安利国)第四章考试重点
第四章细胞培养1、培养细胞分为：贴壁型和悬浮型。
2、细胞培养培养基可分为天然培养基和合成培养基。
3、细胞培养包括原代培养和传代培养。
4、原代培养：指细胞或组织离开有机体之后的首次培养。
5、传代培养：培养细胞生长到一定密度后就需要更换新的培养液，这就是细胞的传代培养。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代或再培养。
6、细胞培养的基本方法有：悬滴培养法、培养瓶培养法、旋转管培养法。
7、常用培养技术有：二倍体培养、克隆培养、同步化培养、大规模培养。
8、原代培养的细胞一经传代就称之为细胞系，是一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。
细胞系经过进一步的克隆化，便得到由单一细胞组成的细胞群体称之为细胞株。
9、动物的细胞与组织培养是从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。
10、1907年Harrison采用淋巴液做培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，创立了在体外观察和研究活组织的方法。
1912年Carrel发现鸡胚胎抽取液有促进细胞生长的作用。
11、贴附包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。
12、根据体外培养细胞在支持物上贴附生长时的形态，大致分为如下四种类型：上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型、多形型细胞。
13、培养细胞的生长特点：贴附、接触抑制（由细胞接触而抑制细胞运动的现象，是区别正常细胞与癌细胞标志之一）密度抑制。
14、细胞周期：指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期，可分为G1期、S期、G2期和M期。
15、细胞系生长阶段包括：原代培养期（指从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段）、传代期（将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代）、衰退期（转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系）16、每代细胞一般要经过三个生长阶段：（1）潜伏期、（2）指数生长期、（3）停止期。
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的定义和范围动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作以及细胞和组织培养技术，以改造细胞、创造新的生物品种或生产生物产品的一门综合性科学技术。
其范围涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、细胞重组、转基因动物等多个方面。
二、动物细胞培养技术（一）基本原理细胞培养是动物细胞工程的基础，其原理是细胞具有分裂和生长的能力。
在适宜的条件下，细胞可以不断增殖并保持一定的生理特性。
（二）培养条件1、无菌环境：防止微生物污染是细胞培养成功的关键。
2、合适的培养基：包含细胞生长所需的营养物质，如氨基酸、维生素、无机盐等。
3、适宜的温度和 pH：一般来说，培养温度在 37℃左右，pH 在 72 74 之间。
4、气体环境：通常需要 95%的空气和 5%的二氧化碳，二氧化碳用于维持培养基的 pH 稳定。
（三）培养过程1、取材：从动物体内取出组织或器官，进行处理以获得单细胞。
2、原代培养：将获得的细胞直接培养，这是细胞培养的第一代。
3、传代培养：当原代培养的细胞生长到一定密度时，进行分瓶培养。
（四）应用1、生物制品的生产，如疫苗、抗体等。
2、细胞生物学和分子生物学的研究。
3、药物筛选和毒性测试。
三、细胞融合技术（一）原理细胞融合是指两个或多个细胞通过物理、化学或生物方法融合成一个杂种细胞的过程。
其原理基于细胞膜的流动性。
（二）方法1、病毒诱导融合：使用某些病毒，如仙台病毒，促使细胞膜融合。
2、化学诱导融合：常用的化学试剂有聚乙二醇（PEG）。
3、电融合：通过电场作用使细胞排列紧密接触，进而融合。
（三）应用1、单克隆抗体的制备：将免疫小鼠的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，分泌单克隆抗体。
2、细胞遗传和细胞免疫的研究。
四、细胞核移植技术（一）原理细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，使其发育成一个新的个体。
这基于细胞核的全能性，即细胞核包含了生物体发育所需的全部遗传信息。
043动物细胞工程-第四章第三节 细胞的基本培养技术
4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。
5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次 TdR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2-7 h取样则为不同 阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待 同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。
有的只有永生性和无异体接种致癌性，有些则相反（恶性）。
第四节 细胞系和细胞株的建立 一、细胞系和细胞株的种类 1．初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内 取出的细胞、组织和器官进行的第一次的 培养物。
2．细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(finite cell line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系(infinite cell line)。
位是否准确、组织是否保持活性、材料处理是否恰当，直接
1.鸡胚组织的取材：用于病毒与疫苗的研究
受精鲜蛋--孵化箱37℃孵育9-12d--从气室处
破壳--挑取鸡胚--按需取材。
2.鼠胚组织的取材：常用材料，易于培养。
杀死小鼠---75%酒精溶液整体消毒2--3s---固
定---剪开皮肤解剖取材。
2.取鼠胚：常用 材料，易于培养。
一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然 的生长阶段。
完成了从体内环境到体外环境的过渡和适
应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力
取材——分离细胞——接种
一、原代培养
优点：组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很 大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生 长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。 （一）．组织取材 决定实验的成败。 取材是原代培养的最初环节，取材的部
细胞工程-动物细胞培养
14
细胞株 (cell strain)：原代培养细胞传至10代左右 就不容易传下去，细胞生长停滞，大部分细胞衰 老死亡，少数细胞能存活传到40~50代，这部分细 胞称为细胞株。
细胞系 (cell line)：细胞株传到50左右不能再继续 传代，部分细胞遗传物质改变，具有癌变细胞的 特点，可以在培养条件下无限制的传代下去，这 部分细胞称为细胞系。
15
动物细胞培养
贴附生长型 (Adherence)
如人胚肺细胞，CHO细胞，巨噬细胞，神经细胞 悬浮生长型细胞 (Suspension)
✓ 新买 ✓ 已用
塑料器皿
金属器皿
5
2.2 接 种
（1）动作要准确敏捷 （2）物品放置有条理 （3）操作有顺序性 （4）防止扩大污染或交叉污染
（吸管，接种Βιβλιοθήκη 具等） （5）工作中尽量少讲话 （6）物品不能经过开放的瓶口上方
6
接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜， 以免空气中微生物落入瓶中
7
• 接种过程中尽可能悬空
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维生素
维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调 节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素 重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以 适合更多的细胞系生长。
维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，与细 胞代谢活动紧密相关。
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脂溶性维生素如：A、D、E、K。 水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶 酸、生物素、C、烟酰胺等。
37
4、其他成份 氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成
高三生物一轮复习动物细胞工程(4)
领域发挥大作用。
5.诱导多能干细胞（iPS细胞） （1）胚胎干细胞的局限性： 胚胎干细胞必须从_胚__胎__中获取 ，涉及_伦_理__问__题__,因而限制了在医学上的应用。
（2）诱导多能干细胞概念： 通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导
细胞株 从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质
没有发生变化。
细胞系 传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去
接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。
区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制， 容易传代培养。
三、干细胞培养及其应用
动物细胞培养
动物细胞 动物细胞融合技术与单克隆抗体
工程
动物细胞核移植技术
克隆动物
一、动物细胞培养
1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适 宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培
养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。
上皮细胞
肌细胞
神经细胞
4.干细胞的应用 （1）应用原理：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、 器官的发育、再生和修复等密切相关。 （2）应用实例： 造血干细胞：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的 造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕 金森病、阿尔茨海默病等）
多能干细胞，简称iPS细胞。
诱导方法：①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、 B细胞均可）；
第二篇动物细胞工程第4章(09)
单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体
外培养时常呈现此种形态。
4)多形型细胞(polymorphic)
生长时像
神经细胞那样呈多角形，并伸出较长的神
经纤维，很难确定它们的形状，因而我们
将此类细胞称为多形型细胞。体外培养时
常见的多形型细胞是神经元和神经胶质细
胞。
2．悬浮型细胞(suspendcell)
3．每代细胞的生长过程
所有体外培养细胞包括原代培养和各种细 胞系(株)，生长达到一定的密度后都须做 传代处理。传代的频率和间隔与接种细胞
数量、细胞生物学性质以及营养液性质等
有关。一般是在细胞长满瓶壁，培养液pH
稍降低时做分离培养。
所谓细胞“一代”，仅指从细胞接种到分 离再培养的一段时间，这已成为培养工作 中的一种习惯说法。如某一细胞系为第 153代细胞，即指该细胞系已传代很快(约5—10min)便可见细
胞形成伪足，与底物形成一些接触点；随
后细胞逐渐呈放射状地伸展开，细胞体的
中心部分变为扁平状；最后，细胞成为成
纤维细胞的形态。
影响因素
离子的作用，细胞的伸展需要有钙离子的存在， 而含低浓度钙的培养液不利于细胞的伸展。
此期细胞移动比较活跃，可见细胞分裂， 但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织相 似性大，更能代表其来源组织的细胞类型 及组织特异质，是药物测试很好的对象。
(2)传代期
原代细胞生长一定时间之后，如是贴附
型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时就
需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，
这个过程叫传代。传代以后的细胞称为细
核苷酸双链分开，易于受到致突变或致癌
物的影响。
(3)G2期
《动物细胞工程》
细胞培养过程中的凋亡等现象会对细胞的产量和纯度造成影响。
2 生命伦理学
动物细胞工程存在各种伦理问题，如生命的权利、自然资源保护等。
3 技术壁垒
动物细胞培养、DNA 编辑等技术的难度较大，有时存在传统工艺无法突破的技术壁垒。
动物细胞工程的前景与应用前景
前景
动物细胞工程技术的进展将支持疾病治疗和再生医学 等领域的发展。
动物细胞工程的发展历程
1
1954-1974
动物细胞培养技术逐步发展，成为细胞学和
1975-1995
2
分子生物学中的重要内容。
基因编辑和重组 DNA 技术的发展使得动物细
胞工程得到了长足的进展。
3
19 9 6- 至今
未来仍有很多新的突破。
动物细胞工程的重要技术
细胞培养技术
培养适宜的细胞提高产量、提高 纯度，得到比较纯净的细胞表达 物。
基因工程
通过人工干预 DNA 基因组的来源， 来研究基因的表达和调控。
基因编辑
利用 CRISPR 技术，可以精准地进 行基因的编辑、替换等操作。
分离纯化技术
通过物理和化学方法进行分离纯 化，获得纯净的蛋白质制品。
动物细胞工程的挑战与难题
动物细胞工程
动物细胞工程是研究使用细胞技术及其工程应用的学科。这种技术有着广泛 的应用领域，旨在为人类健康和福利作出贡献。
动物细胞工程的定义
What
动物细胞工程是研究使用动物细胞技术及其工程应用的学科。
Why
它旨在推动生物产业的发展，为医学研究和制药工业提供支持。
How
通过细胞培养、细胞工程和基因工程等技术，进行细胞培养和发酵等产业生产过程。
动物细胞工程的应用领域
《细胞工程》第4章3：动物细胞培养工程4
4．6．2 基本原理
A、代谢网络理论 • 细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系 统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受 精密调节，又互相协调； • 代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据 可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔 性节点； • 柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对 象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；
D、代谢工程 （也称途径工程，pathway engineering） ——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的 遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶 的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的 功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代 谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络 有目的地被修饰。
累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制
B、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏 酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏 和酶的诱导 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工 多功能酶
4．6．4 代谢工程的研究方法
A、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法——分子生物、生化、物化 代谢通量分析（MFA）— 静态 B、研究 代谢控制分析（MCA）— 动态 方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理 定量分析 控制论模型（CM）— 非线性 途径分析——途径定位
B、β-干扰素（IFN-β） 最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病 毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、 肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为 一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活 性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，
天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化 重组IFN-β 点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。
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B、β-干扰素（IFN-β）
最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病 毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、 肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为 一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活 性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，
B、研究
代谢控制分析（MCA）— 动态
方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理
定量分析 控制论模型（CM）— 非线性
途径分析——途径定位
C、代谢模型的 发展与优化
细胞代谢模型 计算生物学方法
神经网络 遗传算法
D、逆代谢工程
4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．7．1 动物细胞工程产品制备
衣壳——衣壳表面抗原（HBsAg）， 核心抗原
——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸
第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应， 81-82年，美法，85年，中国
第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年， 法美，91、92年，中国
第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达
A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：
B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）
胰岛素依赖型（I）
C、细胞、基因
代谢
治疗糖尿病
紊乱
非胰岛素依赖型（II）
【习题】
1、名词解释，并简要说明它们间关系： 单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养
流加工艺与灌流工艺 CHO与HNK tPA与EPO（NESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫 苗
（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）
（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在 美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）
4．8．4 基因治疗产品
基因治疗（gene therapy）——是指把外界 的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶 细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治 疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方 法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导， 还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细 胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行 细胞治疗。
D、血友病 ——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量过低疾病
4．8．2 MAb药物（参见下图）
——因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）
杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb， 降低抗原识别交叉反应；
4．8．3基因工程与亚单位疫苗
A、乙肝疫苗（参见下图）
4．6．2 基本原理
A、代谢网络理论 • 细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系 统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受 精密调节，又互相协调； • 代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据 可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔 性节点； • 柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对 象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；
《细胞工程》第4章3：动 物细胞培养工程4
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
A、初级分离——离心、过滤、吸附 B、纯化——色谱法 C、制剂与冷冻干燥
4．7．2 动物细胞工程产品的质量控制
纯度 A、物化指标测定 含量
PAGE SDS-PAGE 液相色谱
B、安全性评介 分子量
C、稳定性
4．8 动物细胞工程表达产品的应用
4．8．1 重组蛋白药物
A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，
天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化
重组IFN-β 点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。
C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）
累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制
B、酶合成及酶活性的调节机制
酶的阻遏 和酶的诱导
末端代谢产物阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工
多功能酶
4．6．4 代谢工程的展代谢途径和构建新的代谢途径
常规方法——分子生物、生化、物化
代谢通量分析（MFA）— 静态
D、代谢工程 （也称途径工程，pathway engineering）
——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的 遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶 的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的 功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代 谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络 有目的地被修饰。
生物合成相关代谢调节和调节网络理论 • 代谢工程 代谢流及节点分析
理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析
B、代谢流及中间产物分析——静态分析 C、代谢控制分析——动态分析
4．6．3 代谢调节的基本类型及其机制
A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制
基因治疗与细胞治疗 CNTF与HSC 2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗
B、艾滋病疫苗（参见下图） CHO表达疫苗——理论上，有致瘤性
昆虫细胞表达疫苗 ——昆虫细胞-杆状病毒表达系统
（安全性好，容量大，表达效率高）
C、肿瘤疫苗
灭活自体肿瘤细胞
主动 免疫 同种异体的肿瘤细胞
对细胞因子基因修饰， 加强疫苗免疫原性
树突状细胞（抗原提呈细胞） 体内外诱导CTL生成 （细胞毒性T淋巴细胞） 激发特异性抗肿瘤免疫功能