发酵过程检测与控制-第三章化学参数检测与控制3

大肠杆菌
4.3
枯草芽孢杆菌
4.5
金黄色葡萄球菌 4.2
黑曲霉
1.5
一般放线菌
5.0
一般酵母菌
3.0
6.0—8.0 9.5 6.0—7.5 8.5 7.0—7.5 9.3 5.0—6.0 9.0 7.0—8.0 10 5.0—6.0 8.0
➢不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微 生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线 菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、
在有充足氧的情况下，醋酸菌会将乙醇 氧化成大量的醋酸。而乙醇在有氧的环境中 也会将自已氧化变成乙醛，乙醛又继续氧化 生成乙酸。
pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所
以是十分重要的参数。 “pH”中的“H”代表氢离子（H+），而“p”
的来源则有几种说法。第一种称p代表德语
这个概念是1909年由丹麦生物化学家索 “Potenz”，意思是力度、强度；第二种称
伦·彼得·劳里兹·索伦森（Søren Peder pH代表拉丁文“pondus hydrogenii”，即
pH DO
（2）pH的变化改变代谢产物的合成方向
pH的变化→
→代谢途径与产物合成方向改变
▪同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程 中，对环境pH值要求不同。
例如：丙酮丁醇梭菌
在pH值= 5.5-7.0 时，以菌体生长为主
在pH值= 4.3-5.3 时，进行丙酮丁醇发酵
▪同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累 不同的代谢产物。
醋酸杆菌
3.3.1.1 最适pH
微生物种类 适应环境
细菌
中性
放线菌 中性偏碱
霉菌
偏酸性
酵母
偏酸性
最适pH 对酸敏感度 生长范围
6.5~7.5
敏感
5.0~10.0
7.0~8.0
敏感
5.0~10.0
4.8~5.8 不敏感 1.5~10.0
3.8~6.0 不敏感 2.5~8.0
对于同一种类的微生物，各菌株的最适pH亦有所不同。
• pH对微生物的生长和代谢产物的积累都有很大的影响； • 不同种类的微生物对pH值的要求不同； • 同种微生物在不同的发酵生产中所要求pH值不同。
不同微生物对pH要求不同
➢各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。 低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受 抑制或导致死亡。
微生物种类 最低pH 最适pH 最高pH
pH>4~5
（3）补料控制
——根据发酵过程pH变化的原因采用补料控制pH
例1：在青霉素发酵中，采用按需补糖控制pH • 过量的糖会促使菌体产生有机酸→pH↓→加碱
调节 • 若根据代谢需要流加糖，则pH较稳定→加碱
量↓，且产量↑（25%）
例2：谷氨酸发酵，采用流加尿素或氨水控制pH
• 尿素在尿酶的作用下分解放出氨使pH值上升：
CO(NH2)2 尿酶 2NH3 + CO2
pH↑
• 而培养基中的氨和糖被微生物利用形成谷氨酸，又会
使pH值下降：
C6H12O6 +NH3 + 1.5O2 → C5H9O4N + CO2 +H2O pH↓ • 当氨的消耗速率与尿素（或氨水）的流加速率达平衡
时，pH值将稳定不变。
例3：酵母生产中，流加NH4OH控制pH
发酵过程中pH值的变化一般规律
1.在微生物细胞的生长阶段:
初期:接种后到孢子萌发,因碳氮源代谢水平比 较低, pH一般可维持不变,或者由于添加了CaCO3而 略有上升。
快速生长期：pH值变化较大，因菌种及培养基 不同而上升或下降
2.在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持 在适合产物形成的pH范围。
pH6．9时，菌体生长旺盛，pH7．15时，对菌体的 产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用 阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制 pH6.9，到48h后pH值为7．15，到80h后pH值为 7．25。产率22．27g·/L，产酸率提高12．23％。
应急措施： • 改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，
• 影响营养物质的分解：如酒精发酵是一个边糖化边发 酵的过程，其中淀粉糖化的最适pH为4.5左右，如果pH 值太高，就会影响糖化速度，最终影响酒精发酵。
3.3.1.3 pH对代谢产物形成的影响
（1）生长最适pH与产物形成最适pH
发酵种类 生长最适pH 产物形成最适pH
谷氨酸
7.5~8.0
7.0~7.4
培养液中的NH3被酵母利用后使pH下降： NH4+ → NH3 + H+ → 剩余的H+使pH↓ ↓ 被微生物利用
氨水的加入使pH上升： NH4OH + H+ → NH4+ + H2O pH↑
二者达平衡即可维持pH不变。
（4）培养基配方控制
氮源选择：
尿素和氨水可中和培养过程中的升酸现象 蛋白质和氨基酸具有一定的缓冲作用 铵盐作氮源时可中和培养过程中的碱性物质
丙酮丁醇梭菌 在pH 5.5~7.0范围时，以菌体生长为主， 在pH 4.3~5.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。
最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况
pH对产海藻酸裂解酶的影响
pH对海藻糖水解酶产生的影响 pH——菌浓 pH——酶活
pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响
热凝胶产生不同阶段pH的考察
3.在微生物细胞自溶阶段,养分的耗尽，菌体蛋白酶 的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升。
3.3.2 pH的控制
微生物细胞内的pH值
➢微生物细胞内的pH值相当稳定，一般都接 近中性。 ➢这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够 保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和 细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶 的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH 值接近环境pH值。
发酵过程检测与控制
天津科技大学 郭学武
第三章 化学参数的检测与控制
3.1 溶氧浓度 3.2 溶氧系数的测定方法 3.3 pH与氧化还原电位 3.4 二氧化碳与呼吸商 3.5 基质浓度与补料控制
3.3 pH与氧化还原电位
pH 英文全名hydrogen ion concentration，氢离子浓度指 数,是水溶液中酸碱度的一种表示方法。
控制有机酸的积累量及其代谢速度； • 改变温度，以控制微生物代谢速度； • 改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量； • 改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；
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3.3.3 pH检测
pH试纸 pH检测 取样检测 酸度计 电化学方法
传感器检测
pH电极
pH试纸
HI98105笔式酸度计
pH510台式酸度计
磷源选择：
磷酸可中和培养基中的碱性物质 磷酸二氢钾或钠对碱性代谢物具有一定缓冲作用 磷酸氢二钾或钠对酸性代谢物具有一定缓冲作用 过磷酸钙对碱性代谢物具有一定缓冲作用
天冬酰胺酶
5、不同调pH方法的影响
分别在4种缓冲介质中， 于pH 6．50一9．50测定天 冬酰胺酶酶活力．
1 甘氨酸介质pH 8.00时 酶活力最高；
Handylab pH11台式酸度计
上海雷磁pHS-3C酸度计
氨水
固态发酵中pH和酸度的测定与控制
pH的测定：通常的做法是取一定量的固态物料，加入3倍 其质量的水，浸泡5min后，用电极测定。
酸度对发酵的影响 (1)酸度影晌容池微生态 (2)酸度影晌酒质酒率
入窖酸度过大，曲药中的淀粉酶活力受到 抑制甚至失活， 淀粉糖化不完全， 酒糟中 残留大量糊精， 出现酒糟发粘， 结团， 出酒率下降， 还原糖增高，增加淀粉的消 耗，并且容易使出窖酒糟酸度过大，给下 排生产造成困难；
（2）酸性或碱性代谢物质的形成 如：有机酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸等
（3）培养基比例失调
碳源过多，氮源不足(葡萄糖过量)→有机酸形成→pH↓ 碳源不足，氮源过量→氨基氮释放→ pH↑
（4）杂菌污染
产酸细菌污染→有机酸↑→pH↓ 噬菌体污染→菌体自溶，蛋白质分解→pH↑(如谷氨酸发酵)
微生物的生命活动对环境pH值的影响
但酸度过低，发酵快，升酸迅猛， 不利于 香味成分的生成， 酒味和香味较淡。
酸度的控制措施
（1）前期酸度控制 原料选择：红粮选择贮陈一年的最好。(酶活 性较为稳定，陈粮就差些，新红粮则酶活性 太强，发酵力猛，生酸幅度大，会使材料发 粘。）红粮粉碎要按照冬天细，夏天粗的原 则。 （2）做好内在卫生控制感染酸 （3）做好保温
2、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH 上升。
3.3.2.2 pH控制
（1）无机酸、碱调节 常用酸：盐酸、硫酸 常用碱：石灰水、碳酸钠、氢氧化钠
（2）采用具有缓冲作用的培养基——三角瓶培养、小型试验 例1：细菌培养缓冲剂：等摩尔K2HPO4-KH2PO4，缓冲范围
pH6.4~7.2 例2：CaCO3可作为产酸菌（如乳酸菌、己酸菌等）的缓冲剂，
NaOH)， pH↑
★配制培养基时调整pH值的措施：
★培养过程中调节pH值的措施
过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。
过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。
影响环境pH值的其他因素还包括
1Hale Waihona Puke Baidu产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵 液pH变化。如有机酸类产生使pH下降， 红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素 呈碱性，使pH上升。
Lauritz Sørensen）提出的。
“氢的量”；第三种认为p只是索伦森随意
选定的符号，因为他也用了q。
发酵过程中pH是不断变化的，通过观察 pH变化规律可以了解发酵的正常与否
3.3.1 pH对发酵过程的影响 1、实例
例 pH对林可霉素发酵的影响
pH
pH 7.0
效价
不调pH
t 调pH
例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响 pH在4～7范围内产酶最高
3.3.2 pH的控制
3.3.2.1 影响pH值变化的因素
（1）营养物质的分解与利用 蛋白质物质 蛋白酶 铵离子↑→ pH↑ 氨基酸 脱羧酶 胺类物质↑→ pH↑ 尿素 尿酶 CO2 + NH3 → pH↑ 铵盐的利用使pH值下降： NH4+ → NH3 + H+ 剩余的H+使pH下降 ↓ 被微生物利用
例如：黑曲霉
pH值=2-3时，产物以柠檬酸为主，只产少量 草酸。
pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量 柠檬酸。
pH7.0~8.0 谷氨酸 谷氨酸棒杆菌 5.0~5.8 谷胺酰胺、N-乙酰谷胺酰胺
酵母
pH3.0~6.5 乙醇 7.5~9.0 甘油
黑曲霉
pH2.0~4.0 柠檬酸 6.0~7.0 草酸
★微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：
➢由于有机物分解：
➢分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；
➢分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上 升
➢由于无机盐选择性吸收： NH4+被吸收
➢铵盐吸收（(NH4)2SO4 NO3+被吸收
H2SO4）， pH↓
➢硝酸盐吸收(NaNO3
3.3.1.2 pH对微生物生长的影响
酶的活性损失 （1）pH影响微生物酶的活性 酶的变性失活
（2）改变细胞膜的渗透性： pH的变化→培养液H+ 浓度的变化→细胞膜电 荷性质的改变→细胞膜渗透性的改变→影响 营养物的吸收和代谢产物的排泄→影响新陈 代谢
（3）影响营养物质的利用
• 影响营养物质的离解：如蛋白质、有机酸、氨基酸、 磷酸盐等营养物质在不同pH值下其分子形式不同。
链霉素、红霉素 7.0~8.0
6.8~7.3
金霉素、四环素 利福霉素
7.0~8.0 6.5
5.9~6.3 7.0~7.5
生长的最适pH值与发酵的最适pH值
同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对 pH值的要求也不同。 举例：Aspergillus niger
在pH 2~2.5范围时有利于合成柠檬酸， 当在pH 2.5~6.5范围内时以菌体生长为主， 而在pH 7.0时，则以合成草酸为主。
2 硼酸在pH 8．50，酶反 应最快
3 磷酸在pH 8．50，酶反 应最快
4 Tris在pH 8．50，酶反应 最快
酶活1＞2＞4＞3
异亮氨酸发酵
不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮 氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示 只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联 合控制pH值。
6、发酵的不同阶段采取不同的pH值
例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）
菌株最适生长pH控制在6.8～7.0
不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7．5 时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6．5时 菌体同样受抑制，易于老化。而在7．2左右时，菌 体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6．9左右时， 菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优 势。