T细胞检测技术
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机体接受外来抗原及自身抗原刺激后， 通过细胞免疫和体液免疫及相关系统协同 作用，对抗原产生应答。
T 细胞应答： • T细胞增殖 • 分泌细胞因子 • 细胞毒效应 • 表达特定表面标志
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一、淋巴细胞增殖实验
1、原理
淋巴细胞
刺激物
DNA合成
分化
母细胞
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细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
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2、分子生物学检测 （1）Realtime-PCR （2）分子杂交
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三、T细胞介导的细胞毒实验
特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细 胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径， 介导靶细胞溶解。
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1、51Cr释放实验
铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活 细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形 式被释放。
• 方法学评价 ➢优点：操作简单；重复性强；安全； ➢缺点：CFSE可能干扰细胞增殖
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二、T细胞分泌功能的检测
T细胞经各种丝裂原或特异性抗原刺激后, 分泌的各种细胞因子,可借助免疫学、细胞 生物学及分子生物学技术分别检测细胞因 子含量、生物学活性或基因表达水平，从 而间接反映T细胞功能。
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2、表面标志CD107a/b的检测
CD107a/b表达于T细胞内的质膜上，随着脱颗 粒作用，一过性表达于细胞表面；T细胞表面 CD107a/b的检测可反应T细胞的溶解靶细胞效应。 方法学评价 ➢优点：简便，快速，敏感，不受HLA型别的限制 ➢缺点：脱颗粒作用的非特异性
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抗原特异性精确； （3）ICS：可同时检测产生细胞因子的细胞表
型；需要样本量大于ELISPOT，破膜后的细 胞不能做进一步功能检测；
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方法学评价
➢优点：简单，适用性广，应用特异的单克隆抗体， 可检测单一细胞因子的含量； ➢缺点：无法反应细胞因子的生物活性；不同单克 隆抗体检测的结果不同；敏感性稍差（100pg）
• 方法学评价 ➢优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法； ➢缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；
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2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）
表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后， 皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用 24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。 方法学评价 ➢优点：反应体内杀伤效果； ➢缺点：影响因素多；
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1、生物活性检测 • 对于依赖于该细胞因子而增殖的细胞，
细胞增殖程度与细胞因子含量呈正相关。
• 方法学评价 ➢优点：敏感（pg）；显示细胞因子的活性； ➢缺点：影响因素多（同一细胞分泌多种细胞因子， 多种细胞因子呈现相同功能，细胞因子及其相应受 体同时分泌）；
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2、免疫学检测 （1）ELISA: 操作简单，非特异性影响大； （2）ELISPOT: 高度的敏感性，可重复性强，
谢谢
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四、T细胞表面标志的检测
特异性T淋巴细胞活化需要第一信号和第二信号。 因此检测CTL表面特异性受体或相关的表面标志可 以反映CTL的活化状态。
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1、Tetramer技术
模拟T细胞活化的第一信号，构建荧光标记的 MHC-肽复合物，被特异性T细胞识别。通过检测 标记的荧光，反应活化的特异性T细胞。 方法学评价 ➢优点：简便，快速，敏感 ➢缺点：成本高，受HLA型别的限制
2、检测方法 （1）形态学检测
转化率
转化的淋巴细胞数
100%
转化和未转化的淋巴细 胞数
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方法学评价
➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能 观察结果，适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受
主观因素影响，重复性和准确性较差。
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（2）3H-TdR掺入法（MTT法） PHA 淋巴细胞（54h） 3HTdR掺入 （MTT被还原） 收集细胞，检测β射线（490nm吸光度）
SI
பைடு நூலகம்
试验孔cpm(A490nm )均值 对照孔cpm(A490nm )均值
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
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（3）CFSE（PKH26等）染色法 原理：
CFSE等染料可连结到细胞内蛋白的氨基酸群 （PKH26能插入脂膜），并随细胞分裂而分配到子 代细胞中，每分裂一次，荧光强度减少一倍。
T 细胞应答： • T细胞增殖 • 分泌细胞因子 • 细胞毒效应 • 表达特定表面标志
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一、淋巴细胞增殖实验
1、原理
淋巴细胞
刺激物
DNA合成
分化
母细胞
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细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
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2、分子生物学检测 （1）Realtime-PCR （2）分子杂交
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三、T细胞介导的细胞毒实验
特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细 胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径， 介导靶细胞溶解。
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1、51Cr释放实验
铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活 细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形 式被释放。
• 方法学评价 ➢优点：操作简单；重复性强；安全； ➢缺点：CFSE可能干扰细胞增殖
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二、T细胞分泌功能的检测
T细胞经各种丝裂原或特异性抗原刺激后, 分泌的各种细胞因子,可借助免疫学、细胞 生物学及分子生物学技术分别检测细胞因 子含量、生物学活性或基因表达水平，从 而间接反映T细胞功能。
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2、表面标志CD107a/b的检测
CD107a/b表达于T细胞内的质膜上，随着脱颗 粒作用，一过性表达于细胞表面；T细胞表面 CD107a/b的检测可反应T细胞的溶解靶细胞效应。 方法学评价 ➢优点：简便，快速，敏感，不受HLA型别的限制 ➢缺点：脱颗粒作用的非特异性
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抗原特异性精确； （3）ICS：可同时检测产生细胞因子的细胞表
型；需要样本量大于ELISPOT，破膜后的细 胞不能做进一步功能检测；
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方法学评价
➢优点：简单，适用性广，应用特异的单克隆抗体， 可检测单一细胞因子的含量； ➢缺点：无法反应细胞因子的生物活性；不同单克 隆抗体检测的结果不同；敏感性稍差（100pg）
• 方法学评价 ➢优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法； ➢缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；
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2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）
表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后， 皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用 24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。 方法学评价 ➢优点：反应体内杀伤效果； ➢缺点：影响因素多；
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1、生物活性检测 • 对于依赖于该细胞因子而增殖的细胞，
细胞增殖程度与细胞因子含量呈正相关。
• 方法学评价 ➢优点：敏感（pg）；显示细胞因子的活性； ➢缺点：影响因素多（同一细胞分泌多种细胞因子， 多种细胞因子呈现相同功能，细胞因子及其相应受 体同时分泌）；
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2、免疫学检测 （1）ELISA: 操作简单，非特异性影响大； （2）ELISPOT: 高度的敏感性，可重复性强，
谢谢
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第14页/共18页
四、T细胞表面标志的检测
特异性T淋巴细胞活化需要第一信号和第二信号。 因此检测CTL表面特异性受体或相关的表面标志可 以反映CTL的活化状态。
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1、Tetramer技术
模拟T细胞活化的第一信号，构建荧光标记的 MHC-肽复合物，被特异性T细胞识别。通过检测 标记的荧光，反应活化的特异性T细胞。 方法学评价 ➢优点：简便，快速，敏感 ➢缺点：成本高，受HLA型别的限制
2、检测方法 （1）形态学检测
转化率
转化的淋巴细胞数
100%
转化和未转化的淋巴细 胞数
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方法学评价
➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能 观察结果，适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受
主观因素影响，重复性和准确性较差。
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（2）3H-TdR掺入法（MTT法） PHA 淋巴细胞（54h） 3HTdR掺入 （MTT被还原） 收集细胞，检测β射线（490nm吸光度）
SI
பைடு நூலகம்
试验孔cpm(A490nm )均值 对照孔cpm(A490nm )均值
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
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（3）CFSE（PKH26等）染色法 原理：
CFSE等染料可连结到细胞内蛋白的氨基酸群 （PKH26能插入脂膜），并随细胞分裂而分配到子 代细胞中，每分裂一次，荧光强度减少一倍。