第三章 病毒与亚病毒
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目(噬菌斑形成单位数或感染中心数)。
1.物理颗粒计数:电镜。 2.感染性测定:测噬菌斑、枯斑(须用石英砂 摩擦叶片)和蚀斑数。
上 2-4ml上层培养基 层 培 0.2ml敏感菌悬液 养 0.1ml噬菌体试样 液
噬菌斑
底层培养基
37℃,12h
双层平板法
第三节 病毒复制
一、 病毒的增殖过程 二、 一步生长曲线 (one-step growth curve )
(四)、装配 (五)、释放 裂解和出芽。
二、一步生长曲线(描述烈性噬菌体的复制) 1.具体操作 敏感菌+噬菌体(10/1)。 噬菌体抗血清→去除游离噬菌体。 将培养液高倍稀释→终止抗血清作用。
定时取样0.5mL+0.5mL敏感菌悬液+5mL半固体培养基
混匀→37℃培养,12h→观察测定噬菌斑数。
2.感染性核酸(infectious nucleic acid) 抽提分离的病毒核酸→导入细胞→产生子代毒粒。
(二)病毒的蛋白质 含量多(40-90%);种类少(一种或几种)。 1.结构蛋白 如壳体蛋白、包膜蛋白,主要是保护、参与识别和吸
附。
2.功能蛋白
如溶菌酶、转录酶等、主要参与侵入、释放或复制。
6.如何测定样品中噬菌体的效价? 7.某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而
不能正常生产,在排除了外部感染的可能性后,
有人认为是由于溶源性菌的裂解所致,你的看
法如何?请设计一个实验证明。
2.限制性感染 (restrictive infection) 3.潜伏感染 (latent infection)
1.流产感染
(1)依赖于细胞 病毒 非允许细胞 (缺乏复制酶、tRNA或
细胞因子) 不能复制
如:人肾细胞允许→人腺病毒;猴肾细胞非允许。
(2)依赖于病毒 病毒基因组不完整(缺损病毒)。
(三)、脂类和糖类 都来源于细胞;
种类和含量同于宿主细胞(磷脂+胆固醇);
注:少数无包膜病毒(T系噬菌体、λ噬菌体 等)也有脂类。
三、理化抗性 1.温度
耐冷不耐热,离体,56~60℃,30min→灭活。 保存:低温真空干燥法(-20~-196℃); 适量盐溶液(MgCl2,MgSO4)可提高热稳定性。
1.干扰缺损病毒 (干扰缺损颗粒)
(defective interfering particles)——DI颗粒
2.卫星病毒
3.条件缺损病毒 4.整合的病毒基因组
1.DI颗粒
♦ 复制时产生的基因缺失突变体。
♦ 各病毒均可产生,在高感染复数(m.o.i)时产生频率最
高。
m.o.i :每一敏感细胞表面吸附病毒的数量。
一、病毒的增殖过程(E.coli T4噬菌体)
吸附、侵入、生物合成、装配和释放。
(一)吸附
1.特异性 吸附蛋白(VAP)→ →细胞受体(细胞生长必须)。
2.原理:空间结构的互补性,氢键、疏水性相互作用、 范德华力。
(二)侵入 1.噬菌体:注射。
2.动物病毒
直穿细胞膜; 细胞内吞:累积在细胞质的小泡内→释放;
第三章 病毒与亚病毒
第一节 病毒的性质 第二节 病毒的研究方法
第三节 病毒复制
第四节 病毒的非增殖性感染
第五节 亚病毒
第六节 病毒的可利用价值
第一节
一、形态结构
病毒的性质
二、病毒的化学组成 三、病毒的理化抗性
一、形态结构 1.形态和大小 形态多样, 100nm以下。
2.结构:核(衣)壳+核酸或包膜(来源于核膜或细胞膜)。
核酸(DNA)复制 晚期蛋白(衣壳蛋白、装配酶等)
晚期mRNA
2.核酸复制 (1)基本规律 双链为半保留,单链先合成互补链,再复制。
(2)病毒DNA或RNA的复制
双链DNA和双链RNA复制(半保留复制)
单链+DNA和+RNA复制
先合成负链,再合成正链。 单链-RNA复制 -RNA→+RNA(即mRNA) → -RNA。 逆转录病毒单链RNA复制 RNA → DNA → 双链DNA →单链RNA。
2.射线
击毁病毒核酸。
活性染料(如甲苯胺兰、中性红、丫啶橙)渗入并与
核酸结合→可见光灭活。
3.pH:5.0~9.0稳定。
4.脂溶剂 破坏包膜,如乙醚、氯彷→分类的依据。
5.化学消毒剂
对氧化剂(如高锰酸钾、次氯酸盐)敏感;
酒精、酸碱、环氧乙烷可杀灭。
6.抗生素 不敏感,但患病须注射。
实践应用
• 病毒诊断—大小、形态、数量、组成以及位置→快速鉴别 →辅助诊断。 • 用于生物防治—昆虫病毒→多角体(碱性蛋白)→杀虫。
(二)、病毒的纯化
1.标准
(1)保持感染性;
(2)大小、形态、密度、组成及抗原性均一。 2.方法
盐析、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换等;
超速离心
二、效价测定 效价:指1mL培养液或试样中病毒感染单位数
敏感菌菌苔 溶源菌菌落 透明裂解斑
(3)肿瘤病毒的整合感染 肿瘤病毒(如乙肝病毒)或RNA病毒,一定 条件下可转入复制循环,产生子代病毒。
DNA病毒:直接整合。
RNA病毒:如逆转录病毒。
第五节 亚病毒 一、卫星RNA(拟病毒)
单链RNA片段,在辅助病毒衣壳内,无单独侵
染性。
与辅助病毒无明显同源性。
衣壳对称类型
螺旋对称
二十面体对称
复合对称
二、化学组成
(一)病毒的核酸(DNA或RNA) 1.正极性和负极性
正极性(+RNA):可作为mRNA。 负极性(-RNA):与其mRNA序列互补。 双意RNA:正极性+负极性。 DNA:和mRNA互补→-DNA;和mRNA序列相似→+DNA。
防治痢疾杆菌、耐药性的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。
2.清除藻类污染
3.防治害虫和植物病害:多角体、真菌病毒,卫星RNA等。 4.基因工程工具酶:聚合酶、连接酶、核苷酸激酶等。
练习题
1.名词:烈性噬菌体、噬菌斑、枯斑、蚀斑、包涵体、致 细胞病变效应,噬菌体的效价、一步生长曲线、温和噬 菌体、卫星病毒、朊病毒、溶源菌,溶源转变、感染性 核酸、干扰缺损病毒、整合感染、中和作用。 2.病毒的非增殖性感染有哪几类,引起的原因是什么? 3.一步生长曲线包括哪几个时期,各时期的特点是什么? 4.温和噬菌体的三种存在形式及溶源菌的特性。 5.包涵体有哪些应用?
绘制一次生长曲线(以感染时间为横坐标,噬菌斑数
为纵坐标)。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
噬 菌 斑 数 潜伏期
平稳期 裂 解 期
一步生长曲线
时间
2.三个特征数据:潜伏期,裂解期和裂解量。 裂解量=稳定期病毒效价/潜伏期病毒效价
第四节 非增殖性感染与缺损病毒
侵染后,不产生有感染性子代病毒粒子。 一、非增殖性感染的类型
1.流产感染 (abortive infection)
③蚀斑(空斑)
动物病毒→细胞单层上→病损区。 细胞内部发生“致细胞病变效应”(细胞聚集 成团、肿大、融合成多核细胞,有包涵体或裂 解)。
包涵体(inclusion body)
光镜下可见、圆形、卵圆形或不定形的蛋白质结晶。
组成
• 多为病毒颗粒或病毒亚基; • 少为细胞对感染的反应产物,无病毒粒子。
盲传:第一次接种未出现症状,重复接种。 目的:提高效价。 盲传二代后,仍未症状→无活病毒。
(2)感染表现 噬菌斑、坏死斑(枯斑)、蚀斑(空斑)。
①噬菌斑(plaque)
噬菌体→平板培养物→圆形的透明区域。
有一定的形态,用于分离、鉴定和计数。
噬菌斑
②坏死斑(枯斑)
植物病毒→敏感植物叶片→坏损区域。
二、类病毒 有单独侵染性,单链环状RNA。(其RNA无
mRNA活性)
三、朊病毒:独立复制、无免疫性的疏水性角蛋白。
1982年,美,prusiner发现→1996年诺贝尔奖。
引起的疾病:
疯牛病(牛海绵状脑病);
羊痒疫(羊搔痒症);
人的克-雅氏症(老年痴呆症)等。
第六节 病毒的可利用价值
1.疾病防治
第二节 病毒的研究方法
一、分离与纯化 二、效价测定
一 、分离纯化
(一) 分离 1.标本采集与除菌处理 (1)采集:有足够活病毒。
如倒罐液,感染者血液、分泌物等。
(2)除菌处理 采用抗生素、离心、过滤等。
2.接种与感染表现 (1)接种
考虑宿主范围、组织嗜性;
操作简单、易培养、易判断。
注:
m.o.i=1-300
♦ 须依赖于同源完全病毒才能复制,但基因组小,干扰
完全病毒复制。
2.卫星病毒 绝对缺损,形态结构、抗原性与辅助病毒不同,少有 同源性。 卫星病毒:
E.coli P4噬菌体
(缺壳体蛋白编码基因)
壳体蛋白(合成P4噬菌体外壳)
辅助病毒:E.coli P2噬菌体
3.条件缺损病毒 条件致死突变体,在允许条件→正常增殖;非允许 条件→流产感染或死亡。 4.整合的病毒基因组 温和噬菌体和肿瘤病毒。 (1)温和噬菌体(核酸都是dsDNA ) 有游离噬菌体(游离态)、原噬菌体(整合态或
膜融合:包膜和细胞膜融合。
3.植物病毒:伤口或口器侵入。
(三)生物合成
1.特点:时序性。 早期转录→→次早期转录→→晚期基因表达。 以E.coli的T偶数双链噬菌体为例。
dsDNA
宿主细胞RNA聚合酶
早期蛋白 (次早期RNA聚合酶)
次早期DNA
早期mRNA
次早期mRNA
晚期基因
次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶 等)
质粒形式)和营养噬菌体(营养态)三种存在形式。
(2)溶源菌 ① 特征 溶源性可遗传 可(自发或诱发)裂解 有免疫性 复愈:辐射或氮芥处理,有些菌体会失去原噬菌体。
溶源转变:除免疫性以外获得新性状。
局限转导
② 检出方法 紫外线照射; 将少量溶源菌和大量敏感菌混合,倒平板培养,观 察。 出现独特噬菌斑→溶源菌。
2.限制性感染 细胞瞬时允许,病毒不能复制或仅有少数细胞产生病
毒。如:人乳头瘤病毒,
感染各分化期的上皮细胞,不能晚期转录。 感染分化成熟的鳞状上皮细胞→晚期转录。
3.潜伏感染
在细胞内,不产病毒,不破坏细胞。
可由病毒基因表达,改变宿主→恶性细胞。
二、缺损病毒
主要为基因组有缺陷,须依赖其他病毒才能复制。