第三章 病毒与亚病毒

第二节 病毒的研究方法
一、分离与纯化 二、效价测定
一 、分离纯化
（一） 分离 1.标本采集与除菌处理 （1）采集：有足够活病毒。
如倒罐液，感染者血液、分泌物等。
（2）除菌处理 采用抗生素、离心、过滤等。
2.接种与感染表现 （1）接种
考虑宿主范围、组织嗜性；
操作简单、易培养、易判断。
注：
防治痢疾杆菌、耐药性的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。
2.清除藻类污染
3.防治害虫和植物病害：多角体、真菌病毒，卫星RNA等。 4.基因工程工具酶：聚合酶、连接酶、核苷酸激酶等。
练习题
1.名词：烈性噬菌体、噬菌斑、枯斑、蚀斑、包涵体、致 细胞病变效应，噬菌体的效价、一步生长曲线、温和噬 菌体、卫星病毒、朊病毒、溶源菌，溶源转变、感染性 核酸、干扰缺损病毒、整合感染、中和作用。 2.病毒的非增殖性感染有哪几类，引起的原因是什么？ 3.一步生长曲线包括哪几个时期，各时期的特点是什么？ 4.温和噬菌体的三种存在形式及溶源菌的特性。 5.包涵体有哪些应用？
核酸(DNA)复制 晚期蛋白(衣壳蛋白、装配酶等)
晚期mRNA
2.核酸复制 （1）基本规律 双链为半保留，单链先合成互补链，再复制。
（2）病毒DNA或RNA的复制
双链DNA和双链RNA复制（半保留复制）
单链+DNA和+RNA复制
先合成负链，再合成正链。 单链-RNA复制 -RNA→+RNA(即mRNA) → -RNA。 逆转录病毒单链RNA复制 RNA → DNA → 双链DNA →单链RNA。
2.射线
击毁病毒核酸。
活性染料（如甲苯胺兰、中性红、丫啶橙）渗入并与
核酸结合→可见光灭活。
3.pH：5.0～9.0稳定。
4.脂溶剂 破坏包膜，如乙醚、氯彷→分类的依据。
5.化学消毒剂
对氧化剂（如高锰酸钾、次氯酸盐）敏感；
酒精、酸碱、环氧乙烷可杀灭。
6.抗生素 不敏感，但患病须注射。
衣壳对称类型
螺旋对称
二十面体对称
复合对称
二、化学组成
（一）病毒的核酸（DNA或RNA） 1.正极性和负极性

正极性(+RNA)：可作为mRNA。 负极性(-RNA)：与其mRNA序列互补。 双意RNA：正极性+负极性。 DNA：和mRNA互补→-DNA；和mRNA序列相似→+DNA。
③蚀斑（空斑）
动物病毒→细胞单层上→病损区。 细胞内部发生“致细胞病变效应”（细胞聚集 成团、肿大、融合成多核细胞，有包涵体或裂 解）。
包涵体(inclusion body)
光镜下可见、圆形、卵圆形或不定形的蛋白质结晶。
组成
• 多为病毒颗粒或病毒亚基； • 少为细胞对感染的反应产物，无病毒粒子。
2.限制性感染 细胞瞬时允许，病毒不能复制或仅有少数细胞产生病
毒。如：人乳头瘤病毒，
感染各分化期的上皮细胞，不能晚期转录。 感染分化成熟的鳞状上皮细胞→晚期转录。
3.潜伏感染
在细胞内，不产病毒，不破坏细胞。
可由病毒基因表达，改变宿主→恶性细胞。
二、缺损病毒
主要为基因组有缺陷，须依赖其他病毒才能复制。
质粒形式）和营养噬菌体（营养态）三种存在形式。
（2）溶源菌 ① 特征 溶源性可遗传 可（自发或诱发）裂解 有免疫性 复愈：辐射或氮芥处理，有些菌体会失去原噬菌体。
溶源转变：除免疫性以外获得新性状。
局限转导
② 检出方法 紫外线照射； 将少量溶源菌和大量敏感菌混合，倒平板培养，观 察。 出现独特噬菌斑→溶源菌。
膜融合：包膜和细胞膜融合。
3.植物病毒：伤口或口器侵入。
（三）生物合成
1.特点：时序性。 早期转录→→次早期转录→→晚期基因表达。 以E.coli的T偶数双链噬菌体为例。
dsDNA
宿主细胞RNA聚合酶
早期蛋白 (次早期RNA聚合酶)
次早期DNA
早期mRNA
次早期mRNA
晚期基因
次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶 等)
实践应用
• 病毒诊断—大小、形态、数量、组成以及位置→快速鉴别 →辅助诊断。 • 用于生物防治—昆虫病毒→多角体（碱性蛋白）→杀虫。
（二）、病毒的纯化
1.标准
（1）保持感染性；
（2）大小、形态、密度、组成及抗原性均一。 2.方法

盐析、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换等；
超速离心
二、效价测定 效价：指1mL培养液或试样中病毒感染单位数
第三章 病毒与亚病毒
第一节 病毒的性质 第二节 病毒的研究方法
第三节 病毒复制
第四节 病毒的非增殖性感染
第五节 亚病毒
第六节 病毒的可利用价值
第一节
一、形态结构
病毒的性质
二、病毒的化学组成 三、病毒的理化抗性
一、形态结构 1.形态和大小 形态多样, 100nm以下。
2.结构：核(衣)壳+核酸或包膜（来源于核膜或细胞膜）。
盲传：第一次接种未出现症状，重复接种。 目的：提高效价。 盲传二代后，仍未症状→无活病毒。
（2）感染表现 噬菌斑、坏死斑（枯斑）、蚀斑（空斑）。
①噬菌斑（plaque）
噬菌体→平板培养物→圆形的透明区域。
有一定的形态，用于分离、鉴定和计数。
噬菌斑
②坏死斑（枯斑）
植物病毒→敏感植物叶片→坏损区域。
2.限制性感染 (restrictive infection) 3.潜伏感染 (latent infection)
1.流产感染
（1）依赖于细胞 病毒 非允许细胞 (缺乏复制酶、tRNA或
细胞因子) 不能复制
如：人肾细胞允许→人腺病毒；猴肾细胞非允许。
（2）依赖于病毒 病毒基因组不完整（缺损病毒）。
（三）、脂类和糖类 都来源于细胞；
种类和含量同于宿主细胞（磷脂+胆固醇）;
注：少数无包膜病毒（T系噬菌体、λ噬菌体 等）也有脂类。
三、理化抗性 1.温度
耐冷不耐热，离体，56～60℃，30min→灭活。 保存：低温真空干燥法(-20～-196℃)； 适量盐溶液（MgCl2，MgSO4）可提高热稳定性。
1.干扰缺损病毒 (干扰缺损颗粒)
(defective interfering particles)——DI颗粒
2.卫星病毒
3.条件缺损病毒 4.整合的病毒基因组
1.DI颗粒
♦ 复制时产生的基因缺失突变体。
♦ 各病毒均可产生，在高感染复数(m.o.i)时产生频率最
高。
m.o.i ：每一敏感细胞表面吸附病毒的数量。
目（噬菌斑形成单位数或感染中心数）。
1.物理颗粒计数：电镜。 2.感染性测定：测噬菌斑、枯斑(须用石英砂 摩擦叶片)和蚀斑数。
上 2-4ml上层培养基 层 培 0.2ml敏感菌悬液 养 0.1ml噬菌体试样 液
噬菌斑
底层培养基
37℃，12h
双层平板法
第三节 病毒复制
一、 病毒的增殖过程 二、 一步生长曲线 （one-step growth curve ）
一、病毒的增殖过程（E.coli T4噬菌体）
吸附、侵入、生物合成、装配和释放。
（一）吸附
1.特异性 吸附蛋白（VAP）→ →细胞受体（细胞生长必须）。
2.原理：空间结构的互补性，氢键、疏水性相互作用、 范德华力。
（二）侵入 1.噬菌体：注射。
2.动物病毒
直穿细胞膜； 细胞内吞：累积在细胞质的小泡内→释放；
（四）、装配 （五）、释放 裂解和出芽。
二、一步生长曲线（描述烈性噬菌体的复制） 1.具体操作 敏感菌+噬菌体（10/1)。 噬菌体抗血清→去除游离噬菌体。 将培养液高倍稀释→终止抗血清作用。
定时取样0.5mL+0.5mL敏感菌悬液+5mL半固体培养基
混匀→37℃培养，12h→观察测定噬菌斑数。
二、类病毒 有单独侵染性，单链环状RNA。（其RNA无
mRNA活性）
三、朊病毒：独立复制、无免疫性的疏水性角蛋白。
1982年，美，prusiner发现→1996年诺贝尔奖。
引起的疾病：
疯牛病（牛海绵状脑病）；
羊痒疫（羊搔痒症）；
人的克-雅氏症（老年痴呆症）等。
第六节 病毒的可利用价值
1.疾病防治
6.如何测定样品中噬菌体的效价？ 7.某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而
不能正常生产，在排除了外部感染的可能性后，
有人认为是由于溶源性菌的裂解所致，你的看
法如何？请设计一个实验证明。
敏感菌菌苔 溶源菌菌落 透明裂解斑
（3）肿瘤病毒的整合感染 肿瘤病毒（如乙肝病毒）或RNA病毒，一定 条件下可转入复制循环，产生子代病毒。

DNA病毒：直接整合。
RNA病毒：如逆转录病毒。
第五节 亚病毒 一、卫星RNA（拟病毒）
单链RNA片段，在辅助病毒衣壳内，无单独侵
染性。
与辅助病毒无明显同源性。
绘制一次生长曲线（以感染时间为横坐标，噬菌斑数
为纵坐标）。
噬 菌 斑 数 潜伏期
平稳期 裂 解 期
一步生长曲线
时间
2.三个特征数据：潜伏期，裂解期和裂解量。 裂解量=稳定期病毒效价/潜伏期病毒效价
第四节 非增殖性感染与缺损病毒
侵染后，不产生有感染性子代病毒粒子。 一、非增殖性感染的类型
1.流产感染 (abortive infection)
2.感染性核酸（infectious nucleic acid） 抽提分离的病毒核酸→导入细胞→产生子代毒粒。
（二）病毒的蛋白质 含量多（40-90%）；种类少（一种或几种）。 1.结构蛋白 如壳体蛋白、包膜蛋白，主要是保护、参与识别和吸