核酸的定量测定(定磷法)
定磷法测定核酸的含量
定磷法测定核酸的含量核酸, 含量, 测定【实验目的】掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法【实验原理】核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为：在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。
若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。
【实验材料】1.实验器材恒温水浴,721分光光度计2.实验试剂（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml 容量瓶中，加入5ml5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。
此溶液每1m1含磷400μg，临用时准确稀释20倍(20μg／m1)。
（2）定磷试剂①17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。
②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2):溶液(3):水=1:1:1:2(V:V)（3）5%氨水,27%硫酸【实验操作】1．磷标准曲线的绘制取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。
试剂管号0123456磷标准溶液，ml0.00.050.10.20.30.40.5蒸馏水，定磷试剂加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。
以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
2．总磷的测定称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
核酸的定量测定-定磷法
核酸的定量测定-定磷法1st Edition, revised in March, 2020(本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断!生物素(Biotin定量测定试剂盒使用说明书Biotin quantitative detection kit 产品货号:EBD0325 有效期:12个月使用前请仔细阅读说明书。
如果有任何问题,请通过以下方式联系我们: 全国免费400-660-4808 销售部027-******** 技术部027-******** 电子邮箱(销售QQ 客服联系时请提供产品货号(见试剂盒标签,以便我们更高效地为您服务。
生物素(Biotin定量测定试剂盒使用说明书产品货号:EBD0325(本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!声明:尊敬的客户,感谢您选用本公司的产品。
本产品适用于体外定量检测血清、血浆、乳制品或其它相关生物液体中生物素浓度。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!如有疑问,请及时联系伊莱瑞特生物科技。
试剂盒组成:特别说明:*: [96T/48T](打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整#:一周内使用可存于4℃,需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些,请在使用时量取而非直接倒出!检测原理:本试剂盒采用竞争法。
用生物素包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的生物素与包被的生物素竞争辣根过氧化物酶标记的亲和素(Avidin-HRP上的结合位点,生物素与亲和素特异性结合而形成复合物,游离的成分被洗去。
加入显色底物(TMB,TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。
用酶标仪在450nm波长处测OD值,生物素浓度与OD450值之间呈反比,通过绘制标准曲线计算出样品中生物素的浓度。
试验所需自备物品:1.酶标仪(450nm波长滤光片2.高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL3.37℃恒温箱,双蒸水或去离子水4.吸水纸检测前准备工作:1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。
核酸含量测定(精)
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
实验八核酸的定量测定——定磷法(精)
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O↓(黄色)+6H2O
实验八 核酸的定量测定 ——定磷法
Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧 啶由于其共轭双键系统，都具有吸收紫外线的性质，最大吸 收峰在260nm波长处。
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化
钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
还原剂（抗坏血酸等）
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为
糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。
17
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿
中。 将实验台面擦干净。
18
1
2
34
5
6
标准磷溶液/mL
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
dH2O/mL 定磷试剂/mL
1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值
A660(1)
A660(2)
回收率 0.15 100%
1000
(2) 计算样品总磷量：
x 50
RNA总磷量(g
/ mL)
1.5 回收率
(3) 计算RNA量：
RNA质量浓度（g / mL) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9%） 10.5
总磷量 10.5
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度(g / mL) 100% 2000(g / mL)
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定——定磷法
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
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操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
实验五 定磷法测核酸浓度
六、思考题
1. 为什么实验中需要做空白对照，为什么需要考虑消化 的回收率？对我们今后在做实验中有什么启示？
2. 本实验中反应体系中的还原剂是什么？ 3. 定磷试剂中抗坏血酸溶液在保存过程中发生颜色变化
的原因是什么？
1
-
-
-
-
10mol/L H2SO4/mL
4
4
4
4
4
168-200℃消化30min，溶液呈黄褐色，冷却
30％H2O2（滴）
2
2
2
2
2
168-200℃继续消化至溶液透明，冷却
H2O/mL
2
2
2
2
2
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用水定容/mL
100
100
100
100
100
显色方法P19
3. 注意事项
3
2）无机磷的测定（另外1组同学做总磷测定和无机磷测定）
试剂
0
1
2
RNA样品/ml
－
3.0
3.0
蒸馏水
3.0
0
0
定磷试剂
3.0
3.0
3.0
A660nm
滤纸过滤
3）反应条件： 45℃，25min
3）总磷样品的准备（八人一组）
管号 步骤
0
1
2
3
4
RNA/mL
-
2
2
-
-
标准磷原液 /mL
-
-
-
2
2
H2O/mL
RNA消化的目的？
为什么将原液消化算回收率？
消化回收率
总磷
测定值
核酸鉴定的三种方法
核酸鉴定的三种方法一、紫外吸收法。
1.1原理。
核酸中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有强烈的紫外吸收。
这就像是核酸有一个独特的身份标识，在这个特定的波长下会被检测到。
咱们可以根据这个特性来对核酸进行定性和定量分析呢。
这就好比每个人都有自己独特的指纹，核酸在260nm处的紫外吸收就是它的“指纹”。
1.2操作及判断。
操作起来也不算复杂，把样品放到紫外分光光度计里，测定260nm处的吸光度值。
如果吸光度值在一定范围内，那就说明有核酸存在。
要是这个值比较高，那可能核酸的含量就比较多。
不过这里面也有个小问题，就是有些杂质也可能在这个波长附近有吸收，就像鱼目混珠一样。
所以这个方法虽然简单直接，但也不是百分百准确无误的。
二、琼脂糖凝胶电泳法。
2.1原理。
这就像是一场核酸分子的赛跑比赛。
琼脂糖凝胶就像跑道，核酸分子在电场的作用下在凝胶里迁移。
不同大小的核酸分子迁移速度不一样，就像短跑运动员和长跑运动员速度有差异一样。
小的核酸分子跑得快，大的跑得慢。
这样根据核酸分子在凝胶中的位置，就能判断核酸的大小和大概的纯度了。
2.2操作。
首先要制备琼脂糖凝胶，就像做蛋糕要先准备面糊一样。
然后把核酸样品和上样缓冲液混合，加到凝胶的小孔里，通上电，让它们跑起来。
等跑一段时间后，再用染料染色，这样核酸分子就像穿上了彩色的衣服，在凝胶里能清楚地看到它们的位置了。
2.3结果判断。
如果看到一条清晰的条带，那就说明核酸比较纯。
要是有拖尾或者多条带，那可能就有杂质或者核酸有降解等情况。
这就好比从一个人的走路姿势能看出他是不是健康一样，从核酸在凝胶里的条带情况能判断出核酸的质量好坏。
三、定磷法。
3.1原理。
核酸里面含有磷元素，这可是核酸的一个重要组成部分。
通过测定磷的含量，就能推算出核酸的含量。
这就像是通过数树上的果子数量来推测整棵树的产量一样。
3.2操作及注意事项。
先把核酸样品进行消化处理，让磷元素都释放出来，然后用特定的试剂和磷反应，通过测定反应产物的量来计算磷的含量。
生化实验课件-核酸的定量测定—定磷法
7.5，10，12.5，15 μg，加定磷試劑3ml後搖勻，45 ℃
放置20分鐘，測
。以O含D磷660量為橫坐標，
為
縱坐O標D製660作標準曲線。
2. 核酸中總磷量的測定：
取1ml被測樣品液（約含2.5—5mg核酸，也可取固 體樣品），置於消化瓶中，加入1ml濃硫酸及50mg催
化劑，在消化爐上加熱至發白煙，樣品由黑變成淡黃 色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續加熱至
實驗七 核酸的定量測定—定磷法
一,原理 生物體內有許多含磷化合物，如核酸
（RNA,DNA）磷脂，ATP等。磷的測定方法很多，但在 生化研究中以比色法的應用最為廣泛，該法量微，快 速，準確。
核酸和核苷酸均為含鱗化合物，純的核酸喊磷量為 9%（RNA含磷量為8.5%--9.0%,DNA則含9.2%的磷）。從 核酸中測得了總磷量，就可知樣品中核酸的量，即每 測得1mg有機磷，就表示有11mg的核酸，這就是定磷法 的理論依據
在測定過程中，濃硫酸與核酸共熱使其轉變為無 機磷（此為消化過程），而無機磷與定磷試劑中的鉬 酸銨在酸性條件下反應生成磷鉬酸銨，它在還原劑作 用下被還原成深藍色的鉬藍（高價鉬被還原成低價 鉬），鉬藍在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷 濃度範圍內，藍色的深淺與磷含量成正比
生物有機磷材料中有時含有無機磷雜質，為了消 除無機磷的影響，應同時測定樣品中的總磷量和樣品 中的無機磷含量（樣品未經消化而直接測定的含磷 量）。從總磷量中減去無機磷量，才是樣品中的真正 磷含量。
有机磷量(g) D 11
樣品中核酸含量%=
测定时取样量(ml)
样品重量(g)
100
其中：有機磷量(μg)=總磷量—無機磷量
消化后定容体积(ml) D為稀釋倍數,即= 消化时取样体积(ml)
12生物化学实验--核酸的定量分析
12⽣物化学实验--核酸的定量分析核酸的定量分析【⽬的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的⽅法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分⼦中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之⼀即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分⼦中戊糖的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
RNA 在强酸环境中加热可⽔解产⽣核糖。
核糖在浓酸作⽤下脱⽔形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - ⼆羟基甲苯（地⾐酚）缩合成绿⾊化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热⽔解⽣成的脱氧核糖与浓酸共热脱⽔⽣成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与⼆苯胺反应⽣成蓝⾊化合物（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
⽤强酸使核酸分⼦中的有机磷消化成⽆机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作⽤⽣成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏⾎酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，⽴即被还原为蓝⾊的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为660nm 。
当⽆机磷浓度在 2.5~25µg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正⽐。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中⽆机磷的含量，将测得的总磷量减去原⽆机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进⽽计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分⼦中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最⼤吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定是指通过一种叫做定磷法的方法来确定样品中
核酸的含量。
定磷法是一种常用的生化分析方法，通过测定
样品中含有的无机磷的量，来间接推测核酸的含量。
具体操作步骤如下：
1. 取少量待测样品。
2. 将样品加入到酸性溶液中，使细胞壁和膜完全破裂。
3. 加入含有机溶液的磷试剂，使形成可溶性的金黄色磷酸铵
铬(VI)盐。
4. 根据反应生成的黄色物质的吸收特性，在特定波长下用分
光光度计测量吸光度。
5. 根据构建的标准曲线，确定吸光度与磷含量之间的关系，
从而推测样品中核酸的含量。
需要注意的是，定磷法只能测定样品中的总核酸含量，无法
区分DNA和RNA的含量。
如果需要分别测定DNA和RNA，需要采用其他特异性方法，比如荧光比色法或者核磁共振法等。
核酸的定量测定—定磷法
(1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加 入83ml水中。
(2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水 中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕 色则不能用。
3. 催化剂：硫酸铜（
CuSO 5H O）：硫酸钾
660
计算样品中核酸含量，按下式进行：
有机磷量( g ) D 11 测定时取样量(ml) 100 样品中核酸含量%= 样品重量( g ) 其中：有机磷量(μg)=总磷量—无机磷量
Dቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ稀释倍数,即=
消化后定容体积(ml ) 消化时取样体积(ml )
核苷酸的消化和核酸一样。此外嘌呤类核苷 酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小时脱磷； 嘧啶类核苷酸可用10mol/L H 2 SO4 消化1—2个小 时脱磷。
二，试剂
1.标准磷试剂（含磷5μg/ml）:准确称取恒重 （105℃ ）的 KH 2 PO4 0.4389g,用水定容到100ml，此液 的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5μg/ml。 2.定磷试剂：
取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml， 摇匀，45 ℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白 对照同样操作。 3. 样品中无机磷含量测定： 取未消化的核酸样品液1ml用水定容到50ml。从中取 1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读
OD
660
四，结果
首先制作标准磷曲线，以消化和未消化的样品中的 从标准曲线上查出各自对应的磷含量。 计算样品中核酸含量，按下式进行： OD
在测定过程中，浓硫酸与核酸共热使其转变为无 机磷（此为消化过程），而无机磷与定磷试剂中的钼 酸铵在酸性条件下反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作 用下被还原成深蓝色的钼蓝（高价钼被还原成低价 钼），钼蓝在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷 浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，为了消 除无机磷的影响，应同时测定样品中的总磷量和样品 中的无机磷含量（样品未经消化而直接测定的含磷 量）。从总磷量中减去无机磷量，才是样品中的真正 磷含量。
DNA定量测定
DNA定量测定一，核酸定量测定常见的方法1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。
4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟基-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应二，紫外吸收法1，核酸紫外吸收光谱的测定DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。
吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm 与280nm吸收的比值则在1.8以上。
当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
2，DNA的A260/A280 ≈1.9 表示DNA纯> 2.0 可能有RNA污染< 1.8 可能有蛋白污染3，计算公式DNA（μg ）= （甲A260 –乙A260 ）/ 0.02 ·V·D式中，甲A260 为被测稀释液在260 nm处的A值，乙A260为加沉淀剂（过氯酸-钼酸铵）除去大分子核酸后被测稀释液在260 nm处的A值；V ——为被测试液总体积；D ——为稀释倍数；0.02──脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升溶液内含1μg DNA钠盐在波长260 nm，通过光径为1cm时的A值。
三，二苯胺法在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤、2-脱氧核糖、脱氧嘧啶核苷酸，其中2-脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物。
核酸的定量测定——定磷法
二、实验用品
1、材料
新鲜动物肝脏
2、试剂
（1）Locke氏溶液：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl2 0.024g， NaHCO3 0.015g和葡萄糖0.1g溶于水中，稀释至100ml。 （2）0.5N丁酸溶液：取45ml正丁酸，用1N NaOH液中和至 pH=7.6，并用水稀释至1000ml。 （3）1/15M磷酸缓冲液（pH7.6）： ①1/15M KH2PO4：称9.78g KH2PO4溶于重蒸馏水，稀释到 1000ml； ②1/15 M Na2PO4：称11.876g Na2PO4· 2H2O溶于重蒸馏水。 稀释到1000ml。
四、实验结果
计算样品中丙酮的含量（X） X=（B－A）×0.9667×13÷5 式中： X=样品中丙酮含量； B=滴定对照液所消耗Na2S2O3液ml数； A=滴定样品液所消耗Na2S2O3液ml数； 1ml 0.1N Na2S2O3液相当于0.9667mg丙酮。
注意事项
肝糜必须新鲜，放置过久则失去氧化脂肪酸的能力。
3、保温毕，取出锥形瓶，各加入2 ml三氯醋酸， 在对照瓶中加入3 ml 0.5N丁酸，在样品瓶加入3 ml H2O混匀，静置15分钟，过滤。 4、另取两锥形瓶，分别量入5 ml滤液，5 ml 0.1N 碘液和5 ml 10%NaOH液，摇匀后，静置10分钟。加入 5 ml 10%盐酸液中和，用0.1N Na2S2O3液滴定剩余碘， 滴至浅黄色时，加入3滴淀粉液作指示剂，摇匀后并继 续滴到兰色消失。 5、记录滴定样品与对照所用Na2S2O3的毫升数。
2NaOH +I2─→NaOI +NaI +H2O CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3（碘仿）+CH3COONa +2NaOH 剩余的碘，可以用标准硫代硫酸钠滴定。 NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O I2 +2Na2S2O3─→Na2S4O6 +2NaI
核酸的定量测定-定磷法
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 2O↓(黄色)+6H2O 6H ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
倒入容量瓶，再加水至刻度。
混匀后，吸取3.0ml置于试管中，加定磷试剂3.0ml，摇匀， 45℃保温15分钟，冷却。测其A660nm。
3、无机磷的测定 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试 管中，加定试剂3.0 ml，45℃水浴保温15分钟，冷 却，测其光吸收值。
优点：简单、快速、灵敏度高（可达3μg/ml的检测水平）。 缺点： 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
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⑨吸量管。
⑩分光光度计。
2．试剂：
以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。
①标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH2PO4）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至50毫升（含磷量为1毫克/毫升），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10微克/毫升。
五、结果与讨论：
1．绘制出标准曲线。
2．计算
RNA的含磷量为9.5%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1微克RNA磷相当于10.5微克RNA。将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA磷量尚需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9.9%。
3．测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查出无机磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。
取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1毫升上述消化后定容的样品和空白溶液，如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减
去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。
②定磷试剂3mol·L-1硫酸∶水∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1（体积比）]：配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。
③沉淀剂：称取1克钼酸铵溶于14毫升70%过氯酸中，加386毫升水。
④5mol·L-1硫酸。
⑤30%过氧化氢。
四、操作步骤：
1．标准曲线的绘制：取12支洗净烘干的硬质玻璃试管，按下表加入标准磷溶液、水及定磷试剂，平行作两份。
将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温25分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定光密度。
取两管平均值，以标准磷含量（微克）为：取4个微量凯氏烧瓶，1、2号瓶内各加0.5毫升蒸馏水作为空白对照，3、4号各加0.5毫升制备的RNA溶液（约3毫克RNA），然后各加1.0—1.5毫升5mol·L-1硫酸。将凯氏烧瓶置烘箱内。于140—160℃消化2—4小时。待溶液呈黄褐色后，取出稍冷，加入1—2滴30%过氧化氢（勿滴于瓶壁），继续消化，直至溶液透明为止。取出，冷却后加0.5毫升蒸馏水，于沸水浴中加热10分钟，以分解消化过程中形成的焦磷酸。然后将凯氏烧瓶中的内容物用蒸馏水定量地转移到50毫升容量瓶内，定容至刻度。
测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。
三、器材及试剂：
1．器材：
①分析天平。
②容量瓶（50及100毫升）。
③台式离心机。
④离心管。
⑤凯氏烧瓶（25毫升）。
⑥恒温水浴锅。
⑦200℃烘箱。
目的：
掌握定磷法测定核酸的含量。
二、原理：
在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝
钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。