酶标抗体技术
酶标抗体技术原理
酶标抗体技术原理酶标抗体技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的免疫分析技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的存在。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA 等几种不同的变体，但它们都遵循相似的基本步骤和原理：1.固定抗原：首先，在实验容器（如酶标板）的表面上固定特定抗原。
这可以通过将抗原直接吸附在容器表面上或使用化学交联剂来完成。
2.样品处理：样品（可能含有待检测抗原或抗体）与固定抗原接触，使待检测物质与抗原结合。
这样，如果待检测的是抗原，那么抗原将与固定的抗体结合；如果待检测的是抗体，那么抗体将与固定的抗原结合。
3.第一次抗体结合：添加与待检测物质特异性结合的第一次抗体。
这个抗体会与样品中的待检测物质结合，形成抗原-抗体复合物。
4.第二次抗体结合：添加与第一次抗体特异性结合的酶标记的第二次抗体。
这个酶标记的抗体将与第一次抗体结合，形成一个二抗-一抗-抗原复合物。
5.酶标记物检测：加入适当的底物，使酶标记的第二次抗体产生染色反应。
底物的选择取决于所使用的酶标记，常见的酶标记有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
产生的染色反应可以通过光密度测量仪（spectrophotometer）进行定量测量。
6.结果分析：根据染色反应的强度，可以确定待检测物质的存在和浓度。
一般来说，反应的光密度与待检测物质的浓度成正比。
通过酶标抗体技术，可以检测和定量多种抗原或抗体，广泛应用于医学诊断、药物研发、免疫学研究等领域。
酶标抗体抗原
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HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20
DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
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邻苯二胺 OPD
HRP常用底物
四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
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二、酶联免疫吸附试验的类型
（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理
将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
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（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶
2.糖蛋白（主酶） 主酶与酶活性无关
亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比
4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
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2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一 步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
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（二）酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
双抗体夹心法检测抗原
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
常用酶标抗体制备的技术与方法
(一)酶标抗体的条件1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。
(二)酶标记方法1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。
标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。
然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。
由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。
一步法操作：①抗IgG-AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS 液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。
或冷冻干燥保存。
(2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
酶标抗体技术的原理及应用
酶标抗体技术的原理及应用引言酶标抗体技术是一种常用的生物化学分析方法，基于抗原与抗体的特异性识别和结合原理，通过特定的酶标记和相应基质的反应，实现对生物分子的定量或定性分析。
本文将介绍酶标抗体技术的原理及其在生物科学研究和临床诊断中的应用。
酶标抗体技术的原理酶标抗体技术的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原结合层：首先，需要制备含有抗原的固相材料，例如酶标板。
将待测样品或纯化的抗原加入酶标板孔中，在一定条件下使抗原与酶标板表面结合。
2.非特异性结合层的阻断：添加酶标抗体试剂，用以阻断非特异性结合。
这可以通过加入一些非特异性的蛋白质（如牛血清蛋白）来实现。
3.特异性结合层：添加与抗原特异性识别的抗体试剂，使其与抗原结合。
这些抗体一般被称为第一抗体。
4.酶标记抗体结合层：添加与第一抗体特异性识别的酶标记抗体试剂，使其与第一抗体结合。
这些酶标记抗体往往是用特定方法将酶固定在各种类型的抗体上。
5.酶标记抗体的检测：通过加入相应的基质，使酶标记抗体产生可测量的信号。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），其主要通过与底物反应产生颜色或荧光等信号。
酶标抗体技术的应用酶标抗体技术在生物科学研究和临床诊断中有广泛的应用，具体包括以下几个方面：1.生物学研究：酶标抗体技术可以用于检测和定量目标蛋白质、细胞因子、受体等的表达水平。
借助酶标抗体技术，研究人员可以对生物样品中的特定分子进行定量分析和功能研究。
2.免疫学研究：酶标抗体技术是免疫学研究中最常用的方法之一。
它可以用于检测和鉴定抗原、抗体、免疫球蛋白等，以及研究免疫应答的机制和变化。
3.临床诊断：酶标抗体技术在临床诊断中起着重要的角色。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种基于酶标抗体技术的常用诊断方法，可以检测流行病学调查、疫情监测、传染病诊断等。
4.药物研发：酶标抗体技术也广泛应用于药物的研发与评价。
通过酶标抗体技术，研究人员可以对药物与其作用靶点之间的相互作用进行定量分析，从而加快药物研发的过程。
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
酶标记和免疫层析法技术
❖ TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜 明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只 需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底 物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点， 因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL 或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色， 可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数 或延长浸泡时间。
❖ 显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催
化无色的底物生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中， 加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。
❖ 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后 即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长 反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行 变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入 终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会 使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm） 测读吸光值。
❖ 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲
液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的， 非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团， 其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合， 从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于 亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复 到水溶液状态，从而脱离固相载体。
❖ 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸， 其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISA中一般采用2mol/L。
❖ 即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。 良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保 持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与 抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记 物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶 或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良 好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物 酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。
(仅供参考)ELISA原理及操作注意事项
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌 体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反 应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合， 在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来， 在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过 一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋 白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓， 避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上 强烈振荡。
2.如样品中含有抗原，则优先
竞争结合抗体，结合
为抗原抗体复合物。
酶
3.同时加入酶标记抗原，抗原
酶标记抗原 没有结合的位点酶标记抗原
抗原
去占据，则结合为酶标记抗
抗原
原-抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
抗体
固相载体
酶标抗原竞争法示意图（图d）
五、基本操作注意事项
标本抗原：
天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工 合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇， 纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往 往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固 相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
包被用抗体
IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上， 抗体结合点暴露于外。
血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、 粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗 原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、 尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分 泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本 。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其 他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助 于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、 血 块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医 学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中 血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规 方 法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时 会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增 加 非特异性显色。
酶标抗体技术
酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。
用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。
供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。
前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。
后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
酶免疫技术
1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
（2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性 较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法
（一）斑点-酶联免疫吸附试验 （dot-ELISA ）
原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素 （NC）膜。更灵敏、节约、简便，易 保存 以检测抗体为例：
Ag
Ab1？
Ab2-E
底物
（二）斑点-酶免疫渗滤试验 Immunofiltration Assay，IFA
原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜 的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在 一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方 式迅速完成。以胶体金为标记物的金免 疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更 加简便快速。
（二）类
型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
双抗体夹心法
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
酶免疫标记用于抗原检测
（一）基本原理
酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 很少量的酶即可导致大量的催化过程， 所以极为敏感。
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酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。
用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。
供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。
前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。
后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。
常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。
1、改良过碘酸钠法
HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。
为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。
酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。
[标记步骤]
（1）取5mg HRP溶于蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。
（2）加入1mL L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
（3）加入L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置L，碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠，碳酸氢钠,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 mL 4℃ 2h 或过夜。
（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min 离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。
（7）将沉淀物溶于PBS（）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。
2、戊二醛交联法
戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP 和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。
反应可在4-40℃温度范围，～的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。
戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]
（1）取10mgHRP溶于%戊二醛(用L、将25%戊二醛稀释为%)，室温（20℃左右）反应结合18h。
（2）用LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用L，，4℃透析过夜。
（3）将5mg抗体IgG溶于L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。
（4）加入1mol/L 碳酸盐缓冲液（调节pH至～），4℃，电磁搅拌下结合24h。
（5）加入赖氨酸（溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
（6）装入透析袋，以L、PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
（二）过氧化物酶
简介
抗过氧化物复合物制备技术
Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。
PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。
标记步骤
（1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
（3）加冷生理盐水反复洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉淀物。
（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。
（5）在pH计监控下，边搅拌边加入及L HCl调至左右，使沉淀完全溶解。
（6）立即加入LnaOH,调，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
（7）加入1/10体积的L醋酸钠和L醋酸铵的等量混合液后混匀。
（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用醋酸盐缓冲液（生理盐水、蒸馏水、75mL L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。
（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。
（三）McAb-PAP制备技术
用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。
用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。
以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。
（四）碱性磷酸酶标抗体制备技术
简介
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。
从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为。
它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。
AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
标记步骤
（1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。
（2）装入透析袋，用L、℃透析18h，换液3次。
（3）加入%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。
4℃L、透析过夜，换液3次。
（4）移入L、缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
（5）取出标记抗体，用含%BSA和%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（）分装，4℃保存（使用前以吐温溶液将结合物适当稀释）。
（五）碱性磷酸酶
-抗碱性磷酸酶复合物制备技术
Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。
但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。
杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb 建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。
只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。
采用改良的ELISA方法检测APAAP 复合中AP的最适含量。
具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。
在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。