酶标抗体制备技术
戊二醛二步交联法制备酶标抗体
戊二醛二步交联法制备酶标抗体戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。
戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。
可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。
另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。
(1) 用0.05mol/L，PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS)将25%戊二醛稀释至5%；(2) 称取5mgHRP 溶于0.5ml 5%戊二醛，37℃水浴结合2h；(3) 加入220.0g/L NaCl 0.1ml，充分混匀后，置4℃10min预冷；(4) 加冷无水乙醇2.4ml，颠倒混合，立即1000r/min离心10min；(5) 弃上清，沉淀用冷80%乙醇洗一次，将离心管倒置，控干；(6) 加入0.05mol/L，PH9.5 CBS 0.5ml溶解沉淀物；(7) 将5mg抗体溶于0.5ml 0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液混合；(8) 加入1.0mol/L，pH9.5 CBS，调节pH值至9.0-9.5；(9) 于4℃，电磁搅拌下结合24h；(10)加入0.1ml O.2mol/L赖氨酸，以封闭残留的醛基，终止反应；(11)4℃放置2h；(12)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱，用PBS洗脱，收集第一洗脱峰；或将反应物装入透析袋，对0.01mol/L，pH7.2 PBS，4℃透析过夜并收集；即为酶标记抗体。
【注意事项】(1) 所用的戊二醛A235/A280为10左右，未经蒸馏等处理。
(2) 酶的醛化时间37℃2h、4h和4℃16h无明显区别。
(3) 醛化时，使用的缓冲液以CBS为宜。
(4) 加入220.0g/L NaCl 的目的主要是提高离子强度，以便乙醇沉淀。
(5) 根据有关文献的报道，用50%饱和硫酸铵盐析或Sephadex G-200凝胶柱层析，对于ELISA检测并无实际意义，并常使酶与抗体的活性大量丧失，且这两种纯化法不能去除未标记的抗体，需用ConA-Sepharose 4B 纯化才能达到，因此，在常规工作中，盐析和过柱的纯化步骤可以省略.。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
酶标抗体抗原
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HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20
DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
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邻苯二胺 OPD
HRP常用底物
四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
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二、酶联免疫吸附试验的类型
（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理
将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
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（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶
2.糖蛋白（主酶） 主酶与酶活性无关
亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比
4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
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2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一 步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
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（二）酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
双抗体夹心法检测抗原
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
ELISA_直接法与间接法的区别
ELISA 可用于测定抗原 , 也可用于测定抗体 . 在这种测定方法中有三个必要的试剂 1) 固相的抗菌素原或抗体，即”免疫吸附剂"(immunosorbent);(2) 酶标记的抗原或抗体，称为”结合物"(conjugate);(3) 酶反应的底物 . 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件, 可设计出各种不类型的检测方法 .ELISA 可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型 : (直接法也称一步法)1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 , 操作步骤如下 :1) 将特异性抗体与固相载体联结 , 形成固相抗体 . 洗涤除去未结合的抗体及杂质 .2) 加受检标本 , 保温反应 .标本中的抗原与固相抗体结合 , 形成固相抗原抗体复合物 .洗涤除去其他未结合物质 .3) 加酶标抗体 , 保温反应 .固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 . 彻底洗涤未结合的酶标抗体. 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色 . 固相上的酶催化底物成为有色产物 . 通过比色 , 测知标本中抗原的量 . 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体 , 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法 . 如抗体的来源为抗血清 , 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物. 如应用单克隆抗体 , 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗 , 分别用于包被固相载体和制备酶结合物 . 这种双位点夹心法具有很高的特异性 , 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应 , 作一步检测 .在一步法测定中 , 当标本中受检抗原的含量很高时 , 过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合 , 而不再形成 "夹心复合物 ". 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 , 此时反应后显色的吸光值 (位于抗原过剩带上 ) 与标准曲线 ( 位于抗体过剩带上 ) 某一抗原浓度的吸光值相同 ( 参见 1.3.2, 图 1-4), 如按常法测读 , 所得结果将低于实际的含量 , 这种现象被称为钩状效应 (hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落 . 钩状效应严重时 , 反应甚至可不显色而出现假阴性结果 . 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值 . 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物. 但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题 ,HBsAg 有adr,adw,ayr,ayw4 个亚型 , 虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性 , 这也是用单抗作夹心法应注意的问题 .双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体，多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现岀假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
常用酶标抗体制备的技术与方法
(一)酶标抗体的条件1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。
(二)酶标记方法1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。
标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。
然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。
由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。
一步法操作：①抗IgG-AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS 液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。
或冷冻干燥保存。
(2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
酶标仪的免疫吸附试验的基本原理
酶标仪的免疫吸附试验的基本原理我们到医院去拍片所用到的那些仪器设备都有它的工作原理所在，如果工作人员了解了这些医疗器械的工作原理就能更好的运用仪器。
还能帮助工作人员更好的完成工作。
酶标仪是我们生活中应用的非常广泛的医疗设备，下面就酶标仪的免疫吸附试验的基本原理讲解一下：(一)先将过量的特异抗体（或抗原）包被于载体（酶标板）上，通过抗原抗体反应使待侧物质（抗原或抗体）和酶标记物（用HRP-辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原）也结合在载体上（固相分离），经洗涤去除游离的酶标记物后，加入底物，已经结合在载体上的标记酶促使底物显色。
最终利用光电比色法，对待测物进行定性判断或定量测定。
以上方法的检验灵敏度可以达到ng/ml水平。
（二）包被酶标板：将特异抗原溶液加入酶标板孔内，4℃过夜。
然后用洗涤液洗涤3次到5次（洗板机洗板），这样溶液中的特异抗原被牢固吸附在酶标板的微孔表面，形成固相抗原，残液及杂质被清洗掉。
（三）加入被测样本液（病人血清）：样本液中若含有待测抗体，经过温育反应，则与已包被的抗原产生特异结合，生成包被抗原与待测抗体的复合物，被吸附在酶标板的微孔表面。
然后再次进行洗涤，去除残液及干扰物质。
（四）加酶结合物：经过温育反应，生成包被抗原加待测抗体加酶标抗原的三者复合物，同样被吸附在微孔表面，然后再次洗涤，去除游离的或非特异沾附的酶结合物（洗板）。
（五）加显色液：经过10分钟到20分钟的显色反应，被吸附的复合物中的酶与显色底物液生成有色溶液。
此时，由于游离或非特异吸附的酶已被清除，所以溶液颜色的深浅，仅决定于已与待测物结合的酶的量，因此能真实反映待测物的浓度。
被固化的酶越多，显色就会越深，这就说明待测物的浓度越大。
（六）加终止液：终止显色反应。
使用酶标仪检验：把完成显色的酶标板放在酶标仪仪器上进行光电比色检验，仪器分别检测空白孔、阴阳性对照孔、标准孔、质控孔和患者样本孔的吸光度值，并自动按程序要求计算出患者样本中待测物的浓度或进行定性分析。
STIM1蛋白在相关疾病风险诊断中的应用的制作方法
本技术涉及STIM1蛋白在诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的药物的制备中的用途。
权利要求书1.STIM1蛋白在诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的药物的制备中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病是血栓，优选地为脑血栓，更优选地为脑血栓引起的缺血性脑卒中风。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述诊断包括患有所述疾病的风险的诊断、所述疾病严重程度的诊断和/或所述疾病预后恢复的诊断。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述诊断通过测定外周血中血小板内STIM1蛋白的含量进行，优选地通过酶联免疫定量检测试剂盒进行检测。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述药物中包含所述STIM1蛋白的抗体，优选地包含捕获抗体A和/或酶标检测抗体B。
6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述药物包括试剂盒，优选地，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
7.一种用于如权利要求1至6所述的用途的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包含所述STIM1蛋白的捕获抗体A和所述STIM1蛋白的酶标检测抗体B。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述捕获抗体A和所述酶标检测抗体B通过以下方法制备：(1)单克隆细胞制备：将表达纯化的所述STIM1蛋白与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测；最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后，将小鼠处死，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合；将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后用HT培养液培养，10天后，取细胞培养上清进行检测得到阳性孔；使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，从而建立不少于50株阳性细胞株；(2)单克隆抗体制备与纯化：在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将所获得的阳性细胞株细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水；于4000rpm室温离心腹水15min，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，于13000rpm，4℃离心30min，弃上清；将沉淀溶于0.01M,pH7.4的PBS；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，于13000rpm，4℃离心30min，弃上清；沉淀溶于0.01M,pH7.4的PBS，4℃透析过夜；(3)配对筛选：将纯化后的单克隆抗体作为包被抗体，用pH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:100倍稀释，100μL/孔加至多孔板，4℃包被过夜；含0.2％吐温-20的PBS作为洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为1min，用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:9倍稀释10％羊血清进行封闭，每孔150μL，恒温37℃封闭3小时；加入浓度梯度为1000、100、10、0ppb的STIM1蛋白溶液，加入阴性对照，100μL/孔，25℃，温育45min；洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为1min；将得到的单克隆抗体逐一常规标记辣根过氧化物酶作为检测抗体，用稀释液按1：1000比例稀释，充分混匀，每孔100μl，25℃，温育45min；洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300μL，时间为1min，每孔加TMB 100μL，25℃反应15min；加入2M的H2SO4，100μL/孔，450nm读取吸光度值，选择结合信号最强的一对包被抗体和检测抗体分别作为用于所述试剂盒的所述捕获抗体A和所述酶标检测抗体B。
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
HRP标记抗体原理及方法(戊二醛二步法和过碘酸钠法)
HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一)酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ 值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
更新时间：2004-12-210:30:001971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linkedassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定加入酶反应的底物后，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗15-5）。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。
单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA 提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。
当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备
中,兽医科学 2021，51(01):53-58Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-10-14D01：10.16656/j.issn.l673-4696.2020.0208 中图分类号：S852.43 文献标志码：A文章编号：1673_4696(2021)01-0053-06大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备骆琢\王振斌\李明恒\王兴龙”，潘广林2*(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100;2.陕西省林业科学院珍稀野生动物救护基地，陕西周至710402)摘要：为获得辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗大熊猫IgG抗体，本研究利用重组大肠杆菌表达技术对 大熊猫IgG F c片段进行了表达，获得重组蛋白后进行了小鼠免疫，抗体特异性检测，并进行了多克隆抗体的 HRP标记。
结果显示，在37 °C、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导5h的条件下，可获得分子质量约为88k u的目的蛋白；将重组蛋白免疫小鼠后，免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1 : 102 400以上，且与大熊猫血 清IgG反应良好，经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫IgG效价可达1 :25 600以上。
上述结果表明，本研 究成功制备了 HRP标记的小鼠抗大熊猫IgG二抗，为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。
关键词：大熊猫；IgG F c;酶标二抗Preparation of HRP enzyme-labeled second antibody againstgiant panda IgG FcL U O Chen1，WANG Zhen-bin1,LI Ming-heng1，WANG Xing-long1*,PAN Guang-lin2*(1. College of Veterinary Medicine , Northwest A &F University, Yangling 712100, China；2.Rare Wildlife Rescue Base .Shaanxi Academy o f Forestry .Zhouzhi 710402, China)Abstract：In order to obtain HRP labeled anti-giant panda IgG antibody,the giant panda IgG Fc fragment was expressed by recombinant E.coli expression technique. The recombinant protein was immunized in mice,the antibody specificity was detected,and the polyclonal antibody was labeled with HRP. The results showed that the target protein with molecular weight of about 88 ku could be obtained under the condition of 37 °C ,IPTG concentration of 0.5 mmol/L and induction for 5 h.After immunizing mice with the recombinant protein,the reaction titer of the immunized mouse serum with the recombinant protein was more than 102 400 and reacted well with the giant panda serum IgG. The titer of mouse anti-giant panda IgG labeled by HRP labeling kit can reach more than 25 600. The results showed that the HRP labeled mouse anti-giant panda IgG secondary antibody was successfully prepared,which provided support for the development of serological detection methods for giant panda diseases.Key words：giant panda；IgG Fc；enzyme labeled secondary antibody* Corresponding authors：WANG Xing-long,E-mail ：wxlong@nwsuaf. edu. cn；PAN Guang-1 in,E-mail ：33954979@qq. com大熊猫是食肉目、熊科、大熊猫亚科、大熊猫属 猫的生存状况受到广泛关注。
酶标抗体技术的原理及应用
酶标抗体技术的原理及应用引言酶标抗体技术是一种常用的生物化学分析方法，基于抗原与抗体的特异性识别和结合原理，通过特定的酶标记和相应基质的反应，实现对生物分子的定量或定性分析。
本文将介绍酶标抗体技术的原理及其在生物科学研究和临床诊断中的应用。
酶标抗体技术的原理酶标抗体技术的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原结合层：首先，需要制备含有抗原的固相材料，例如酶标板。
将待测样品或纯化的抗原加入酶标板孔中，在一定条件下使抗原与酶标板表面结合。
2.非特异性结合层的阻断：添加酶标抗体试剂，用以阻断非特异性结合。
这可以通过加入一些非特异性的蛋白质（如牛血清蛋白）来实现。
3.特异性结合层：添加与抗原特异性识别的抗体试剂，使其与抗原结合。
这些抗体一般被称为第一抗体。
4.酶标记抗体结合层：添加与第一抗体特异性识别的酶标记抗体试剂，使其与第一抗体结合。
这些酶标记抗体往往是用特定方法将酶固定在各种类型的抗体上。
5.酶标记抗体的检测：通过加入相应的基质，使酶标记抗体产生可测量的信号。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），其主要通过与底物反应产生颜色或荧光等信号。
酶标抗体技术的应用酶标抗体技术在生物科学研究和临床诊断中有广泛的应用，具体包括以下几个方面：1.生物学研究：酶标抗体技术可以用于检测和定量目标蛋白质、细胞因子、受体等的表达水平。
借助酶标抗体技术，研究人员可以对生物样品中的特定分子进行定量分析和功能研究。
2.免疫学研究：酶标抗体技术是免疫学研究中最常用的方法之一。
它可以用于检测和鉴定抗原、抗体、免疫球蛋白等，以及研究免疫应答的机制和变化。
3.临床诊断：酶标抗体技术在临床诊断中起着重要的角色。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种基于酶标抗体技术的常用诊断方法，可以检测流行病学调查、疫情监测、传染病诊断等。
4.药物研发：酶标抗体技术也广泛应用于药物的研发与评价。
通过酶标抗体技术，研究人员可以对药物与其作用靶点之间的相互作用进行定量分析，从而加快药物研发的过程。
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度) 0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
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酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基)构成一种糖蛋白(含糖18%)。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小(40kDa)，标记物容易穿透入细胞内部;作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺(DAB)为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察;在pH3.5~12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min;用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性;溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化;氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物(供氢体)都可以用显色剂。
供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。
前者最常用的为3，3'二氨基联苯胺(3,3'diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法;反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查;此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。
后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别;易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种;但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。
常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。
改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。
为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。
酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的结合物。
[标记步骤](1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20℃±)下轻微搅拌作用1h。
(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温(20℃±)下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(Ig)，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
(5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。
(6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2SO4溶液(硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2)6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉(SPA 不需要进行此步)。
(7)将沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
(8)在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
戊二醛交联法戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。
反应可在4-40℃温度范围，pH6.0~8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。
戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤](1)取10mgHRP 溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温(20℃左右)反应结合18h。
(2)用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
(3)将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。
(4)加入0.1mL 1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0~9.6)，4℃，电磁搅拌下结合24h。
(5)加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
(6)装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
过氧化物酶折叠简介抗过氧化物复合物制备技术Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP)法，此法也称为非标记抗体酶法(unlabelled antibody enzymemethod)。
PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。
标记步骤(1)取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
(2)加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温(20℃±)静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
(3)加冷生理盐水反复洗涤-离心(16 000r/min，4℃离心20min)3次，弃上清，取沉淀物。
(4)加入过量HRP溶液4mL(2mg/mL)混匀后，移至小烧杯内。
(5)在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。
(6)立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
(7)加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。
(8)电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
(9)以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
(10)加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵)4℃透析3d，每天换液2次。
(11)17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
(12)加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。
McAb-PAP制备技术用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。
用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP 复合物。
以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。
碱性磷酸酶标抗体制备技术简介碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)，系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。
从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6;从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。
它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。
AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
标记步骤(1)取抗体(2~5mg/mL)1mL，加入AP 5mg溶解。
(2)装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。
(3)加入2.5%戊二醛20uL，室温(20℃±)放置2h。
4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。
(4)移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
(5)取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
(6)加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量(0.1mL)分装，4℃保存(使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释)。
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物制备技术Mason等(1978)，用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)桥联酶标技术。
但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。
杨志刚等(1989)利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。
只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。
采用改良的ELISA 方法检测APAAP复合中AP的最适含量。
具体方法是:用羊抗鼠Ig包被微量滴定板;加入一定量的抗APMcAb;分别加入不同量的AP作用后经过洗涤;加底物显色，测定光密度值(OD)。
在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大;当AP增加到一定量时(约6~8mg/mL)、OD值保持稳定。