直接抗人球蛋白试验阳性的意义讲义
23例直接抗人球蛋白试验阳性患者输血结果分析及血液成分选择_徐静
23例直接抗人球蛋白试验阳性患者输血结果分析及血液成分选择徐静（赣州市人民医院输血科，江西赣州341000）摘要：目的：对使用微柱凝胶交叉配血中直接抗人球蛋白试验阳性结果进行分析，探讨解决疑难配血的处理方法，并选择合适的血液成分。
方法：对使用微柱凝胶交叉配血中23例直接抗人球蛋白试验阳性患者的临床资料进行回顾分析。
结果：23例直接抗人球蛋白试验阳性患者微柱凝胶交叉配血试验中2例为不规则抗体阳性、主次侧均为阳性，21例为不规则抗体阴性、主侧阴性次侧阳性。
结论：不规则抗体阳性、主次侧均为阳性的为自身溶血性贫血患者，宜选择不规则抗体对应抗原阴性的滤白洗涤红细胞；不规则抗体阴性、主侧阴性次侧阳性的血液病及尿毒症患者宜选择滤白洗涤红细胞；药物导致的不规则抗体阴性、主侧阴性次侧阳性贫血患者可选择滤白悬浮红细胞。
关键词：直接抗人球蛋白试验；疑难配血；血液成分中图分类号：R457．1+3文献标志码：A文章编号：1001－5779（2012）06－0875－02在输血前微柱凝胶交叉配血试验中常发现不相容，究其原因是患者直接抗人球蛋白试验（DAT）阳性，给治疗带来困难。
直接抗人球蛋白试验（DAT）是利用抗人球蛋白血清与体内已被不完全抗体或补体致敏的试验。
这些患者血清中往往含有自身抗体，当这些患者需要输血治疗时，自身抗体或同种抗体给输血前的交叉配血和血液成分的选择造成了很大的困难。
1资料与方法1．1一般资料本院2012年3 9月23例DAT阳性患者，年龄21 73岁，其中男12例，女11例，其中血液病7例，肾脏疾病6例，自身溶血性贫血1例，骨髓移植1例，外科使用头孢类药物引起的疾病8例。
1．2材料—578—1．2．1仪器与试剂微柱凝胶卡专用离心机TD-3A型（长春博迅生物技术有限公司提供）及孵育器FYQ型；微柱凝胶卡（长春博迅生物技术有限公司提供）；筛检细胞、反定型细胞（上海血液生物医药公司提供）。
1．3方法23例DAT阳性患者用微柱凝胶法交叉配血，使用与患者ABO血型及Rh（D）血型相同供血者标本进行交叉配血及抗体筛查试验。
抗人球试验
直接抗人球蛋白试验1. 原理抗人球蛋白试验，又称Coombs’试验，是诊断自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的重要依据。
用人球蛋白免疫动物使其产生抗体即抗人球蛋白。
抗人球蛋白试剂可凝集被人球蛋白致敏的红细胞。
抗人球蛋白试剂可以喝致敏在红细胞上人球蛋白反应，通过桥梁作用使致敏红细胞出现凝集，呈现阳性反应。
2. 试剂组成抗IgG，C3d（多特异性）10ml/支，1支/盒抗IgG 5ml/支，1支/盒抗C3d 5ml/支，1支/盒3. 试剂保存2-8℃保存，勿反复冻融，储存条件下有效期为24个月。
4. 样本要求应用EDTA抗凝标本，可反应体内红细胞被补体致敏的真实情况，弱怀疑冷抗体引起的直接抗球蛋白试剂阳性，其血液标本凝固应保持在37℃，直到血清被分离出来为止。
5. 操作步骤5.1 直接抗球蛋白试验5.1.1将1滴受检者3%红细胞悬液加入干净的小试管中,用盐水洗涤3次以2400转/分，离心1分钟，每次洗涤后，将上清液全部倒出。
5.1.2加入2滴抗IgG，C3d（多特异性）或者抗IgG或抗C3d，以2400转/分，离心15分钟，用肉眼或借助显微镜管凝集，并按程度记录结果。
5.1.3判断结果必须一定角度轻轻地摇动试管直到松动所有的细胞，然后反复倾斜试管，直到均匀的细胞悬液（阴性）或者凝集物（阳性）为止。
5.1.4如阴性结果，在室温中放置5-10分钟，再离心一次，重读结果。
这样做，阴性反应有时会变成阳性。
注意：仅对C3D和IgA致敏的红细胞有增强作用，IgG致敏红细胞反而会变弱（见注意事项）。
5.2 阳性对照（IgG抗D致敏细胞）5.2.1每批新世纪，或在4℃保存时间过长，需做阳性对照，只要每月一次，1滴阳性对照细胞加2滴直接抗人球蛋白试剂，离心判定结果。
5.2.2在试验中，于判断为阴性的试管内加入1滴阳性对照细胞，再离心，然后重悬液，判定结果。
如果最初洗涤能充分除去所有未结合的球蛋白，结果为阳性。
这是一个重要的对照，因为这是检测细胞是否洗涤充分的唯一方法。
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验（coombs实验）
直接试验：实验原理：本实验是检查不完全抗体试验，包括直接试验和间接试验。
直接试验和间接试验阳性为红细胞表面不完
全抗体存在及血清中游离的不完全抗体存在，判定结果凝
集为阳性。
试剂：
1、受检者红细胞：取患者全血脱纤维蛋白或抗凝，离
心除上清液，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，
然后制成10%的红细胞悬液。
2、受检血清
3、正常0型混合红细胞：取数名正常0型抗凝血，离
心除血浆，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，然
后制成10%的红细胞悬液。
4、抗人球蛋白血清
5、抗D血清
6、AB血清
7、0.85%生理盐水
操作方法：
取试管3支
1 2 3
反应物（低）
受检者阳性对照阴性对照
受检者压积红细胞 2 ——
对照同型压积红细胞— 2 2
抗D血清— 4 —
AB血清—— 4
将2 3 管置37℃水浴中1小时，然后3支试管均用大量生理盐水洗涤两次，每管再以生理盐水配成10%的红细胞悬液。
直接试验：
取小试管4支
反应物（滴）
受检者盐水对照阳性对照阴性对照
抗人球蛋白血清 2 — 2 2。
《抗人球蛋白试验》课件
监测治疗效果和复发
抗人球蛋白试验在监测治疗效 果中的应用
抗人球蛋白试验在预测复发风 险中的应用
抗人球蛋白试验在评估治疗效 果和复发风险中的局限性
抗人球蛋白试验在临床实践中 的应用案例
抗人球蛋白试验的 注意事项
试验前的准备
确保试验环境清洁、无菌 准备试验所需的试剂和仪器 确保试验人员具备相应的专业知识和技能 确保试验对象符合试验要求，并签署知情同意书
抗人球蛋白试验的 发展趋势和展望
抗人球蛋白试验的进展
抗人球蛋白试验的发展历程 抗人球蛋白试验的应用领域 抗人球蛋白试验的技术进步 抗人球蛋白试验的未来发展趋势
抗人球蛋白试验的未来发展方向
应用领域：拓展到更多疾病 诊断和治疗领域
标准化：建立统一的检测方 法和标准，提高检测结果的
可比性
技术进步：提高检测灵敏度 和准确性，降低检测成本
抗人球蛋白试验的优缺点
优点：操作简单，结果准确， 可用于检测多种疾病
缺点：需要专业人员操作， 成本较高，可能存在假阳性
和假阴性结果
抗人球蛋白试验的 应用
诊断自身免疫性疾病
抗人球蛋白试验： 用于检测自身免疫 性疾病的抗体
自身免疫性疾病： 免疫系统攻击自身 组织或器官的疾病
应用：抗人球蛋白 试验可以帮助诊断 多种自身免疫性疾 病
应用：用于诊断和治疗多种 疾病，如系统性红斑狼疮、
类风湿性关节炎等
目的：检测人体内是否存在 抗人球蛋白抗体
重要性：有助于医生制定更 准确的治疗方案，提高患者
的生活质量
抗人球蛋白试验的 方法
直接抗人球蛋白试验
原理：通过检测血清中抗人球蛋白抗体的含量，来判断是否感染了某些疾病 步骤：取患者血清，加入抗人球蛋白抗体，观察反应结果 结果判断：如果出现凝集反应，说明患者感染了某些疾病 注意事项：试验过程中要避免污染，保证结果的准确性
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验介绍：
抗人球蛋白试验是检查不完全抗体的常用方法，是诊断自身免疫性溶血性贫血的最重要的试验。
一般分为直接试验和间接试验两种。
直接试验的目的是检查红细胞表面的不完全抗体，间接试验的目的是检查血清中是否存在游离的不完全抗体。
抗人球蛋白试验正常值：
直接试验：阴性
间接试验：阴性
抗人球蛋白试验临床意义：
(1)自身免疫性溶血性贫血：温抗体型直接法阳性、间接法阴性。
(2)药物诱发的免疫性溶血性贫血：
①α-甲基多巴型：直接和间接法均阳性。
②青霉素型：直接法阳性、间接法阴性。
③福阿亭型：直接法阳性。
(3)冷凝集素综合征：直接法阳性、间接法阴性。
(4)新生儿同种免疫溶血病：直接和间接法均阳性。
(5)直接法阳性：传染性单核细胞增多症、系统性红斑狼疮、恶性淋巴瘤、慢
性淋巴细胞性白血病、癌肿、铅中毒、结节性多动脉炎、Evans氏综合征(伊文斯氏综合征、特发性血小板减少性紫癜合并获得性溶血性贫血)、阵发性寒冷性血红蛋
白尿症等。
(6)直接法阴性：遗传性球形细胞增多症。
抗人球蛋白试验注意事项：
本试验对免疫性溶血的诊断特异性较强而敏感性较差，容易出现假阴性的结果。
以下情况会出现假阴性：患者红细胞表面IgG量少，试剂效价不高，自身抗体
亲和力较低，发病初期引用大量肾上腺激素等。
抗人球蛋白试验检查过程：暂无相关信息。
抗人球蛋白试验原理
抗人球蛋白试验原理
抗人球蛋白试验是一种常用的实验方法，用于检测血清中的抗
人球蛋白抗体水平。
该试验原理基于抗原与抗体的特异性结合，通
过测定血清中的抗人球蛋白抗体水平，可以评估机体的免疫状态，
对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
首先，进行抗人球蛋白试验需要准备好相应的试剂和标本。
试
剂包括抗原、抗体、底物和显色剂等，而标本则是患者的血清样本。
在实验操作前，需要将试剂和标本按照要求进行准备和稀释，确保
实验的准确性和可靠性。
接下来，将稀释后的血清标本和抗原共同孵育，使抗原与抗体
发生特异性结合。
在孵育的过程中，抗体与抗原结合形成免疫复合物，这一过程是实验的关键步骤。
经过充分孵育后，将未结合的抗
体和抗原洗去，以消除非特异性结合的干扰因素。
然后，将底物加入反应体系中，底物与酶标记的二抗结合，形
成底物-酶标记的二抗-抗体-抗原免疫复合物。
接着，加入显色剂，
底物受酶作用产生显色反应，生成可测量的产物，其光密度与抗体
水平成正比。
通过测定产物的光密度，可以间接反映出血清中抗人
球蛋白抗体的水平。
最后，根据产物的光密度值，结合标准曲线进行定量分析，得
出血清中抗人球蛋白抗体的浓度。
根据浓度值，可以评估机体的免
疫状态，诊断疾病的发展和变化，指导临床治疗和预后判断。
总的来说，抗人球蛋白试验原理基于抗原与抗体的特异性结合，通过测定血清中的抗体水平，间接反映出机体的免疫状态。
该方法
操作简便，结果可靠，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义，是
一种常用的免疫学实验方法。
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验1．原理:直接抗人球蛋白试验是检查体内致敏红细胞的方法，用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏。
如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）溶血性输血反映（输入的不相合红细胞被受血者不完全抗体致敏）自身免疫性溶血性贫血（患者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴药物，青霉素等所致）。
2．标本收集：取新鲜抗凝血（肝素抗凝）2ml ，颠倒混匀，立即送检。
3．存放：收到标本后，立即送检4．运输：送标本时避免振摇。
5．标本拒收的标准：标本不能有溶血现象发生，姓名、床号不符。
6．实验材料：6．1 试剂：抗人球蛋白血清（广谱及单价）6．2 用不完全抗D致敏5% Rho(D)阳性红细胞盐水悬液共阳性对照用。
操作如下：取3人O 型红细胞混合，生理盐水洗涤3次，取压积红细胞加等量抗D血清，置37℃水浴致敏1小时，取出后离心去除上清液再用盐水配成5%红细胞悬液。
6．3 正常人5% D阳性红细胞悬液(未致敏),供阳性对照用。
6．4 载玻片，吸头。
7．操作步骤:7．1 取收检者红细胞，以生理盐水洗涤3次，配成5% 红细胞盐水悬液。
7．2 上述5% 受检者红细胞悬液1滴置于玻片上，加抗人球蛋白血清1滴混匀。
7．3 阳性对照：加不完全抗D 血清致敏的5% D 阳性红细胞悬液1滴，加抗人球蛋白血清1滴混匀。
7．4 阴性对照：正常人5% D 阳性红细胞悬液1滴加抗人球蛋白血清1滴，混匀。
8．检验结果的判断与分析：如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者直接抗人球蛋白试验为阳性，不凝集者为阴性。
9．质量控制：做阴、阳性对照，不用过期试剂。
10．注意事项：10．1标本采取后应立即进行试验,延迟或中途停止可使抗体从细胞上丢失。
10．2受检红细胞一定要用盐水洗涤3次,除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白,以防止假阴性结果。
10．3 最好对阴性结果进行核实，即在试管中加1滴IgG致敏红细胞，如果为阳性，则表示试管内的抗球蛋白血清确实被消耗。
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验（coombs实验）
直接试验：实验原理：本实验是检查不完全抗体试验，包括直接试验和间接试验。
直接试验和间接试验阳性为红细胞表面不完
全抗体存在及血清中游离的不完全抗体存在，判定结果凝
集为阳性。
正常结果：均为阴性。
临床意义：阳性见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、阵发性寒冷性血红蛋白尿、药物致免疫性溶贫、输血引起溶贫和新生儿同种免疫性溶贫。
阴性不能排除免疫性溶贫。
试剂：
1、受检者红细胞：取患者全血脱纤维蛋白或抗凝，离
心除上清液，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，
然后制成10%的红细胞悬液。
2、受检血清
3、正常0型混合红细胞：取数名正常0型抗凝血，离
心除血浆，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，然
后制成10%的红细胞悬液。
4、抗人球蛋白血清
5、抗D血清
6、AB血清
7、0.85%生理盐水
操作方法：
取试管3支
1 2 3
反应物（低）
受检者阳性对照阴性对照
受检者压积红细胞 2 ——
对照同型压积红细胞— 2 2
抗D血清— 4 —
AB血清—— 4
将2 3 管置37℃水浴中1小时，然后3支试管均用大量生理盐水洗涤两次，每管再以生理盐水配成10%的红细胞悬液。
直接试验：
取小试管4支
反应物（滴）
受检者盐水对照阳性对照阴性对照
抗人球蛋白血清 2 — 2 2。
抗人球蛋白试验
抗人球蛋白试验，又称Coombs’的重要依据。
【参考值】正常人直接与间接试验均为阴性，Coombs’试验阴性有时并不能排除AIHA。
【临床意义】直接试验是检查被检红细胞上有无不完全抗体，间接试验是检查血清中游离的不完全抗体。
直接Coombs’试验较间接试验对AIHA更有诊断价值。
用特异性单价抗血清可将AIHA 分为三型：IgG／C3阳性，占67％；单独IgG性，占20％；单独C3性，占13％；阳性结果本试验阳性结果主要见于下列几种情况：1.自身免疫性贫血，（IgG）型引起的溶血性贫血，本试验直接反应常呈强阳性，间接反应大多阴性，但亦可阳性。
2.型：直接反应阳性，间接反应阴性，以上二型如以正常红细胞先与有关药物于37℃培育后再加病人血清、间接反应均为阳性。
③福阿亭型：（奎宁等药物）抗体通常为IgM，偶有IgG 型者，直接反应为阳性，间接反应阴性，但如用IgG抗血清做试剂则结果大部分均为阴性，但如培育时加入新鲜正常人血清（供应补体）则结果为阳性。
37℃下进行）由于本病红细胞膜附着的是补体C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做试验时，则结果阴性，如以抗补体的抗血清做试验则直接反应阳性。
4.新生儿同种免疫溶血病，因Rh血型不合所致溶血病，直接及间接反应均强阳性，持续数周、换血输血后数天内可变为阴性，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，结果常为阴性或弱阳性。
5.红细胞血型不合引起的输血反应，ABO或Rh血型不合输血，供者的红细胞被受者的血型抗体致敏，在供者被致敏的红细胞完全破坏以前，直接反应阳性，Rh阴性者如过去不曾接受过Rh阳性者的血或曾妊娠胎儿为Rh阳性者，间接反应阳性，如无上述接触，第一次输血后（Rh阳性的血），数天之内间接反应也会变为阳性。
6.SLE铅中毒、结节性动脉周围炎、EVan氏综合征等，病人直接反应亦可阳性，阵发性寒冷性血红蛋白尿症患者中，急性发作后用抗补体血清做试验直接反应常为阳性。
输血前不规则抗体筛查与直接抗人球蛋白试验的意义
输血前不规则抗体筛查与直接抗人球蛋白试验的意义目的探讨对输血患者在输血前实施直接抗人球蛋白试验以及不规则抗体筛选的检查结果，并总结检查临床意义。
方法输血前患者2000例，实施不规则抗体筛选以及直接抗人球蛋白试验（DAT）两种辅助检查，分析结果以及研究性别、既往妊娠史和输血史对结果的影响。
结果不规则抗体筛查检查阳性率为0.20%，直接抗人球蛋白试验结果阳性率为1.05%；既往输血史或者妊娠史是影响不规则抗体筛查以及直接抗人球蛋白试验结果的相关因素。
结论不规则抗体筛查以及直接抗人球蛋白试验可以针对检查结果实施输血，避免溶血反应，临床上对患者安全以及治疗有很大帮助。
标签：输血；直接抗人球蛋白试验；不规则抗体筛查；微柱凝胶法现阶段的文献资料显示引起溶血反应的最主要原因是红细胞不规则抗体（irregular antibodies）[1，2]，而不规则抗体产生原因不一，可能是妊娠免疫产生，也可能是多次以及大量的输血产生[3]，红细胞不规则抗体因缩短了红细胞存活时间，严重的导致威胁生命的免疫溶血性输血反应，因此目前对输血患者要事先进行不规则抗体的检查以及筛选，以此保证患者临床输血安全性[4]。
实施直接抗人球蛋白试验（DAT）的目的是验证不完全抗体是否导致了红细胞过敏[5]，而DAT的工作原理是体内由于不完全抗体（或补体）引起红细胞致敏因此发生凝集。
检查结果阳性的患者的配血将会难度增加，国外的实施方法微柱凝胶技术已经广泛使用[6]。
本研究选择2010年12月～2012年12月间浙江省嵊州市人民医院住院部输血前患者共2000例，检查方法具体为微柱凝胶法，具体实施不规则抗体筛选以及DAT两种辅助检查，检查结束后对结果显示阳性的标本进一步实施抗体特异性鉴定检查。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2010年12月～2012年12月间浙江省嵊州市人民医院住院部輸血前患者共2000例，其中男1102例，女898例，年龄1～87岁，中位年龄（56.45±6.29）岁；包括643例孕产妇、手术需血712例、住院部治疗645例。
抗球蛋白实验(直接Coombs实验和间接Coombs实验)
抗球蛋白实验（直接Coombs实验和间接Coombs实验）
机体受某些抗原刺激后，可产生不完全抗体，由于这种抗体体积较小、长度短，只能与颗粒抗原一方相结合(又称单价抗体)，因而不能出现
肉眼可见的凝集反应。
Coombs首先根据抗体存在于球蛋白，注入异种动物的球蛋白又是抗原
的原理，将含有不完全抗体的血清球蛋白免疫异种动物，获得抗球蛋
白抗体，此种抗体可以起到桥梁作用，连接已结合有不完全抗体的抗原，产生肉眼可见的凝集反应，这种反应称为抗球蛋白实验。
抗球蛋
白实验又称Coombs实验，经常用作实验的有两类方法，即为直接Coomb
s实验和间接Coombs实验。
一、直接Coombs实验
将含球蛋白的试剂直接加到红细胞表面结合抗体的细胞悬液中，即可
见细胞凝集。
可用玻片法定性测定，也可用试管法作半定量分析。
常
用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医
源性溶血性疾病等的检测。
直接Coombs实验
二、间接Coombs实验
用以检测游离的血清中的不完全抗体。
将受检血清和具有待测不完全
抗体相应抗原性的红细胞相结合。
再加入抗球蛋白抗体就可出现可见
的红细胞凝集。
此实验多用于检测母体Rh(D)抗体，以便及早发现和避
免新生儿溶血症的发生。
亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗
体进行检测。
间接Coombs实验
Coombs实验除了广泛应用于血液病的检测外，还可采用专一特异性的抗球蛋白的血清如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗补体血清等，分析结合于红细胞上的不完全抗体的免疫球蛋白亚类。
直接抗人球蛋白试验原理
直接抗人球蛋白试验原理抗人球蛋白是直接抗人球蛋白试验中的重要试剂。
抗人球蛋白是由兔、羊等动物免疫人类IgG和/或IgM制备而成。
在制备过程中，先将兔、羊等动物注射人类IgG和/或IgM，使其产生抗体。
然后将动物的血清收集，离心去除血细胞和血浆，得到抗人球蛋白。
2. 直接抗人球蛋白试验的步骤（1）取被测血液样本。
在抗凝管中加入适量的抗凝剂（EDTA、肝素等），轻轻颠倒管子使其混匀。
（2）离心。
将抗凝管中的血液样本离心，离心后将上清液倒入离心管中。
（3）洗涤红细胞。
将离心管中的红细胞沉淀洗涤4-5次，去除血浆和细胞碎片。
（4）加入抗人球蛋白。
将抗人球蛋白加入洗涤后的红细胞中，使其与红细胞表面的抗体结合。
（5）离心。
将含有抗人球蛋白的红细胞离心，去除上清液。
（6）检测结合情况。
加入适量的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG抗体，使其与抗人球蛋白结合。
HRP标记的抗兔IgG抗体能与抗人球蛋白结合的红细胞表面的IgG和/或IgM结合，形成颜色反应。
（7）检测结果。
颜色反应的程度与红细胞表面的抗体和补体结合的程度成正比，可通过比较样品与对照的颜色反应程度来判断是否存在抗体和补体结合于红细胞表面。
3. 结果的解释直接抗人球蛋白试验结果可分为阳性和阴性两种。
阳性结果表示被测血液中存在抗体和/或补体结合于红细胞表面，可能是自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病等疾病的表现。
阴性结果表示被测血液中不存在抗体和/或补体结合于红细胞表面。
4. 注意事项（1）抗人球蛋白试验前应检查被测血液中是否存在抗凝剂，如存在应及时更换。
（2）洗涤红细胞时应注意避免过度洗涤，以免破坏红细胞膜。
（3）HRP标记的抗兔IgG抗体应保存在4℃以下，避免受热、受光、受冻等影响。
（4）进行抗人球蛋白试验时应严格遵守实验室安全操作规程，避免对人身安全造成威胁。
总之，直接抗人球蛋白试验是一种常用的检测血液中抗体和补体结合于红细胞表面的试验，可用于诊断自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病等疾病。
直接抗人球蛋白试验原理
直接抗人球蛋白试验原理
直接抗人球蛋白试验（DTH）是一种用于检测免疫系统细胞介导免疫反应的方法。
原理：
1. 抗原处理：将人球蛋白制备成小片段，加入适量的乳化剂，制成抗原悬液。
2. 免疫刺激：将抗原注射到被试者皮内，刺激机体免疫系统产生特异性细胞免疫反应。
3. 反应过程：T淋巴细胞感知到抗原后，释放多种细胞因子，引起炎症反应，进而导致皮肤组织细胞浸润和增生。
4. 结果评价：通过观察皮肤上是否出现红斑、硬结等症状来判断实验结果。
应用：
1. 诊断疾病：如结核病、过敏性疾病等。
2. 评价免疫反应：对疫苗免疫效果、免疫调节剂治疗效果等进行评价。
3. 研究免疫机制：DTH可用于研究T细胞介导免疫反应的免疫机制。
注意事项：
1. 根据实验要求制备合适浓度并充分乳化的抗原，避免过度刺激免疫
系统。
2. 操作前应了解被试者既往免疫史和疾病史，特别是过敏等反应。
3. 实验后应进行严密观察，发现异常反应及时处理。
4. DTH仅是定性的检测方法，需要进一步综合评估实验结果。
实验7-直接抗人球蛋白实验PPT课件
呈阴性反应。 ❖ 全凝集、冷凝集血标本或脐血标本，试验前应充分洗涤，否则产生假阳
性。
14
实验重点掌握： ❖ 直接抗人球蛋白试验的原理及临床意义
15
1、采集3人份O型RhD阳性抗凝全血，1000g离心3min， 分离血浆；红细胞经生理盐水（NS）3次洗涤后，取3人份 的压积红细胞各5滴混匀，备用；
2、用一次性吸管取压积红细胞3滴于试管中，加入2倍体积 的单克隆IgG抗D血清，混匀，置于37℃孵育45min；
3、孵育结束取出试管，1000g离心2min，弃上清，用2倍 体积的NS洗涤3次（1000g离心1min），最后加入NS配制 成约5％的致敏红细胞悬液（1d压积红细胞＋19d NS），备 用
3
抗球蛋白试剂通常有三种： ❖ 多特异性抗球蛋白试剂，简称多抗，多抗包括了抗-IgG和
抗- C3两种成分，在直抗试验中常常作为初筛试剂使用。 ❖ 单特异性抗-IgG试剂，简称抗-IgG ❖ 单特异性抗-C3试剂，简称抗-C3 ❖ 在直抗试验中一旦出现阳性结果，通常需要抗-IgG和抗-C3
进一步分析。
9
未致敏红细胞（阴性对照）： 取3滴3人份混合压积红细胞，加入57滴NS混匀，备用。
（无须单克隆IgG抗D血清致敏）
10
受检者标本检测
❖ 标记3支试管，分别为待检管、阴性对照和阳性对 照。按下表加入各反应物：
反应物 5％待检标本RBC 5％阴性对照RBC 5％阳性对照RBC 多特异性抗球蛋白试剂
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结果判定
❖如阳性对照凝集，阴性对照不凝集，受检RBC凝集 者直接抗球蛋白试验为阳性，不凝集者为阴性。
实验7直接抗人球蛋白实验
洗涤红细胞
将红细胞洗涤多次， 去除血浆中的干扰物 质。
进行实验
将抗人球蛋白血清与 洗涤后的红细胞混合， 观察反应结果。
结果判定
根据显微镜下观察到 的反应结果，判断是 否为阳性或阴性。
02
实验材料
实验器材
01
试管
用于混合和离心处理。
02
移液管
用于精确测量溶液。
03
离心机
用于分离血清和红细胞。
04
显微镜
05实验总结与展望Fra bibliotek实验总结
实验原理
直接抗人球蛋白实验是一种用于检测红细胞表面是否存在不完全抗体（IgG和IgM）的 实验。这些不完全抗体可以引起红细胞凝集，导致溶血性贫血。
实验步骤
实验包括洗涤红细胞、加抗体、离心和观察结果等步骤。
实验结果
实验结果为阳性或阴性，阳性结果表明存在不完全抗体，阴性结果表明不存在不完全抗 体。
阳性结果
若直接抗人球蛋白实验结果为阳性， 则表示样本中存在针对红细胞抗原的 抗体，即红细胞抗原已被致敏。
结果解读
阴性解读
阴性结果通常表明患者未发生免疫性溶血性贫血等疾病，但 也需要结合其他检查结果和临床表现进行综合判断。
阳性解读
阳性结果提示患者可能存在免疫性溶血性贫血等疾病，需要 进一步检查和确诊。同时，阳性结果也可能出现在某些生理 或非免疫性因素导致红细胞抗原暴露的情况下。
观察红细胞凝集现象。
实验试剂
抗人球蛋白抗体
用于检测红细胞上的抗体。
盐水
用于清洗红细胞。
缓冲液
维持实验体系的pH值。
标记抗体
用于标记红细胞上的抗体。
实验样本
患者血清
含有待检测的抗体。
抗球蛋白试验(Coombs试验)
抗球蛋白试验（Coombs试验）抗球蛋白试验（Coombs试验）介绍：抗球蛋白试验，又称为Coombs试验。
指检测血液中不完全抗体的一种方法。
抗球蛋白试验（Coombs试验）正常值：阴性。
抗球蛋白试验（Coombs试验）临床意义：抗球蛋白试验常用于溶血性贫血辅助诊断、血型鉴定、交叉配血等。
阳性：见于自身免疫性疾病(如自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、阵发性冷性血红蛋白尿症、系统性红斑狼疮、结节性动脉周围炎)、药物免疫性和同种免疫性溶血性贫血等。
抗球蛋白试验（Coombs试验）注意事项：一、抽血前的注意事项1、抽血前一天不吃过于油腻、高蛋白食物，避免大量饮酒。
血液中的酒精成分会直接影响检验结果。
2、体检前一天的晚八时以后，应开始禁食12小时，以免影响检测结果。
3、抽血时应放松心情，避免因恐惧造成血管的收缩，增加采血的困难。
二、抽血后应注意1、抽血后，需在针孔处进行局部按压3-5分钟，进行止血。
注意：不要揉，以免造成皮下血肿。
2、按压时间应充分。
各人的凝血时间有差异，有的人需要稍长的时间方可凝血。
所以当皮肤表层看似未出血就马上停止压迫，可能会因未完全止血，而使血液渗至皮下造成青淤。
因此按压时间长些，才能完全止血。
如有出血倾向，更应延长按压时间。
3、抽血后出现晕针症状如：头晕、眼花、乏力等应立即平卧、饮少量糖水，待症状缓解后再进行体检。
4、若局部出现淤血，24小时后用温热毛巾湿敷，可促进吸收。
三、检验前请告知医生近期用药情况及特殊生理改变。
抗球蛋白试验（Coombs试验）检查过程：暂无相关信息。
直接抗人球蛋白试验阳性的意义
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2、在血清中的自身抗体 是IgG型的，与所有的红细胞在间接抗人
球蛋白试验中都呈阳性反应。血清中的游离抗体 量非常少。
3、放散液中 可检到IgG抗体。
4、自身抗体特异性
主要是针对Rh抗原复合物，但只有在得到
稀有表现型红细胞，如D阴性，或Rhnull时才能 明确
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3、放散液 若红细胞在37℃收集和洗涤，细胞上没
有 免疫球蛋白，放散液中不会有反应发生。
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4、自身抗体的特异性
最 常 见 与 CAS 有 关 的 特 异 性 为 抗 I 。
较不常见的抗i特异性则与感染性单核
球症有关。
在及稀有的情况下，血清中冷反应性
自身凝集素具有Pr特异性或其他特异性。
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自身免疫性溶血性贫血
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一、概念
▪ 免疫性溶血 免疫性溶血是指由于免疫反应而使红细
胞破坏加速，寿命缩短的过程。
▪ 溶血性贫血 溶血性贫血是由于红细胞破坏增多、增
速， 超过造血补偿能力范围，所发生 的一种贫血。
▪ 自身免疫性溶血性贫血
是由于机体免疫功能异常，产生了抗
自
身红细胞的抗体，使红细胞破坏加速
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阵发性寒冷性血红蛋白尿（PCH）
是DAT阳性的自身免疫性溶血性贫
血症最少见的类型，成人中很少见，儿
童中占32%。
较 为 常 见 PCH
是急性暂时的情况，继发于病毒感染症，
尤其在幼童当中。它也能出现在老年人
中，为一特发性的慢性病。
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抗人球蛋白试验(直接法)
抗人球蛋白试验（直接法）简介抗人球蛋白试验（直接法）是一种常见的免疫学实验方法，用于检测机体内特定抗体（抗人球蛋白抗体）的水平和活性。
通过这一试验可以评估机体对人球蛋白的免疫反应情况，是许多研究和临床诊断工作中重要的实验手段之一。
实验原理抗人球蛋白试验（直接法）基于抗原-抗体相互作用的原理。
人球蛋白是一种外源蛋白，当人体受到人球蛋白的免疫刺激后，机体会产生抗人球蛋白抗体。
通过将待测血清与标准人球蛋白溶液混合反应，通过测定溶液中抗体与抗原结合的程度，进而评价该血清中抗人球蛋白抗体的水平。
实验步骤1.准备试剂：标准人球蛋白溶液、待测血清、辅助试剂等。
2.取等量的标准人球蛋白溶液和待测血清，混合均匀。
3.将混合溶液孵育一段时间，促使抗体与抗原结合。
4.添加特定试剂，使未结合的物质沉淀或产生其他特定反应。
5.通过光密度仪或其他检测仪器测定光密度值，计算出抗体水平。
实验结果分析实验结果以光密度值或其他测量指标呈现，一般抗体水平较高的样本对应较高的光密度值。
通过比较待测样本的结果与标准曲线或对照组的结果，可以判断该样本中抗人球蛋白抗体的水平及活性。
应用领域抗人球蛋白试验（直接法）在免疫学研究、临床诊断以及药物疗效评价等领域有着广泛的应用。
例如，在自身免疫性疾病的诊断中，该试验可帮助医生评估患者的免疫系统功能状态；在药物疗效评价方面，可用于监测药物对患者免疫功能的影响。
结论抗人球蛋白试验（直接法）是一种重要的实验技术，可以用于评估机体对人球蛋白的免疫反应水平。
通过本实验，我们可以深入了解机体免疫系统的功能状态，为研究和临床诊断提供有力的支持。
直接抗人球蛋白试验
直接抗人球蛋白试验直接抗人球蛋白试验介绍：直接抗人球蛋白试验是诊断自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的重要依据，检查被检红细胞上有无不完全抗体，又称Coombs’试验。
直接抗人球蛋白试验正常值：直接抗人球蛋白试验呈阴性。
直接抗人球蛋白试验临床意义：异常结果：试验阳性1. 自身免疫性贫血，(IgG)型引起的溶血性贫血，本试验直接反应常呈强阳性。
2. 药物诱发的免疫性溶血性贫血，与间接反应共同反应疾病。
3. 冷凝集素综合征直接反应阳性4. 新生儿同种免疫溶血病，因Rh血型不合所致溶血病，直接强阳性，持续数周、换血输血后数天内可变为阴性，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，结果常为阴性或弱阳性。
5. 红细胞血型不合引起的输血反应，ABO或Rh血型不合输血，供者的红细胞被受者的血型抗体致敏，在供者被致敏的红细胞完全破坏以前，直接反应阳性。
6. 其它在传染性单核细胞增多症、SLE、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、癌肿、铅中毒、结节性动脉周围炎、EVan氏综合征等，病人直接反应亦可阳性，阵发性寒冷性血红蛋白尿症患者中，急性发作后用抗补体血清做试验直接反应常为阳性。
需要检查的人群：有软弱无力疲乏、困倦，皮肤、黏膜苍白，心悸，头晕、头痛、耳鸣、眼花、注意力不集中、嗜睡症状的人群。
直接抗人球蛋白试验注意事项：不合宜人群：无检查前禁忌：注意休息与饮食，空腹抽血。
检查时要求：用肝素或EDTA抗凝血做直接Coombs’试验。
直接抗人球蛋白试验检查过程：采用静脉采血进行检测。
静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水分。
所用针头应锐利、光滑、通气，针筒不漏气。
先用30g/L碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%乙醇棉签以同样方法拭去碘迹。
以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，食指固定针头下座，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤，然后以5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。
直接Coombs试验
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•不完全抗体 能够与相应的抗原牢固结合,但因其分子量较小,体积
小,不能起到桥联作用,在一般条件下不出现可见反应。 •Coombs试验用于检测不完全抗体
直接Coombs试验：检查红细胞上有无不完全抗体。 间接Coombs试验：检查血清中有无游离的不完全抗体。
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二.直接Coombs试验
（一）直接Coombs试验基本原理
若红细胞在体内被不完全抗体吸附，由于不 完全抗体分子量小，体积小，不能起到桥联作用 ，仅使红细胞处于致敏状态，在一般条件下不出 现可见反应。加入抗球蛋白试剂，与红细胞上吸 咐的不完全抗体结合，在致敏红细胞之间搭桥， 出现肉眼可见的凝集。
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三.直接Coombs试验临床意义
• 自身免疫性溶血性贫血 • 新生儿溶血症 • 溶血性输血反应 • 药物诱发的免疫性溶血性贫血
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直接Coombs试验
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➢Coombs试验概述 ➢直接Coombs试验原理及方法 ➢直接Coombs试验临床意义
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2一.Coombs试验源自述• 1945年，英国免疫学家Coombs等人发明的一种能检 测红细胞表面抗体的新试验，故称之Coombs试验， 亦称抗人球蛋白试验。
人球蛋白试剂（抗IgG、C3d、IgG/C3d）； 5.轻轻混匀后3000r/min离心15s，轻轻摇动试管，观察结果。
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是DAT阳性的自身免疫性溶血性贫
血症最少见的类型，成人中很少见，儿
童中占32%。
较 为 常 见 PCH
是急性暂时的情况，继发于病毒感染症，
尤其在幼童当中。它也能出现在老年人
中，为一特发性的慢性病。
PCH典型的血清学特征
1、直接抗球蛋白试验 PCH中的自身抗体是IgG，它和IgM冷
自身凝集素一样，在身体较冷的部位， PCH的IgG自身抗体与红细胞起反应，使 补体成分（C3及C4）与红细胞发生不可逆 的 结 合 ， 然 后 在 较 温 暖 的 部 位 IgG 分 离 。 所以直抗阳性是补体造成的。
（二）在有自身抗体存在时检测同种抗体
1、有温型反应性抗体存在时检测同种抗体
▪ 自身吸收 ▪ 异体吸收法 ▪ 稀释技术
直接抗人球
蛋白试验阳 性的意义
红细胞膜受某些药物（以头孢菌素类最多见） 疗法而改变，导致蛋白质（包括免疫球蛋白） 非特异性地被红细胞膜所吸收
对给予药物（如奎尼丁及非那西丁）的反应形 成药物-抗药物复合体，使补体成分、IgG抗体 （占少数）与红细胞相结合
为减少器官及骨髓移植患者的T细胞群体，应 用有嗜异性抗体存在的马抗人淋巴细胞球蛋白 时
▪ 洗脱液中有抗体活性吗？
四、具有自身抗体的患者的血清学检查
（一）、输血前试验中可能存在的问题
1、 冷型反应性自身抗体能引起自身凝集 反应，致使ABO及Rh分型试验结果发 生矛盾。自身抗体亦凝集血清分型试 验所用的A型和B型试剂红细胞。
2、 被球蛋白致敏的红细胞在接触到高蛋白含 量的商品化的抗-Rh 血清试剂时，可发生 自发性的凝集反应，致使 Rh 定型试验的 结果发生矛盾。
1、 温抗体型自身免疫溶血性贫血（WAIHA） 原发性的 （自发性） 继发性的 （与淋巴瘤、系统性红斑狼疮、 癌症或药物处理有关）
2、 冷凝集素综合征（CAS） 原发性的 （自发的） 继发性的 （与淋巴瘤支原体肺炎、传染性 单核细胞增多症 有关）
三、血清学特征
温抗体型自身免疫溶血性贫血 （WAIHA）
2、用硫醇类试剂（2-Me、DTT等）处理红细 胞。
3、反定型中，可将血清和A、B红细胞在37 ℃ 预热进行试验。
4、用吸收后血清进行试验（自身吸收的或用 纯合子O型红细胞吸收的
解决Rh定型中的问题
1、由冷自身抗体造成可用解决ABO定型问题 的方法来避免。
2、由IgG致敏的红细胞，试验必须要进行适当 的对照试验。 或使用使用有盐水反应活性 的试剂。
4、自身抗体的特异性
PCH的自身抗体大部分呈现抗-P特异性， 与所有的红细胞（包括病人自己的红细胞）起 反应，与罕见p或Pk表现型不反应。亦有例子 报告具有抗-I、抗-i和抗-Pr等特异性。
▪ 病人的红细胞是抗体还是补体致敏？ ▪ 血清中有抗体吗？
如果有，这些抗体是凝集 还是非凝集性抗体？ 体外溶血吗？ 最适反应温度是暖（37 ℃ ）还是冷（4 ℃ ）？ 是自身抗体还是同种抗体？
常见的自身免疫性溶血性贫血， 约占 所有免疫性溶血性病例的48~70%， 与温反应性自身抗体有关
WAIHA典型的血清学特征
1、直接抗球蛋白试验 使用单特异性IgG及抗C3试剂时，可有三种
形式的反应： 单独IgG反应、单独C3致敏、IgG+C3致敏，
2、在血清中的自身抗体 是IgG型的，与所有的红细胞在间接抗
3、放散液 若红细胞在37℃收集和洗涤，细胞上没有
免疫球蛋白，放散液中不会有反应发生。
4、自身抗体的特异性 最 常 见 与 CAS 有 关 的 特 异 性 为 抗 I 。
较不常见的抗i特异性则与感染性单核 球症有关。
在及稀有的情况下，血清中冷反应性 自身凝集素具有Pr特异性或其他特异性。
阵发性寒冷性血红蛋白尿（PCH）
▪ 自身免疫性溶血性贫血
是由于机体免疫功能异常，产生了抗自 身红细胞的抗体，使红细胞破坏加速造 成的溶血性贫血，在后天性溶血性贫血 中多见。
二、分类
免疫性溶血性贫血可分为三类
▪ 同种免疫性溶血性贫血 ▪ 自身免疫性溶血性贫血 ▪ 药物引起的免疫性溶血性贫血
自身免疫性溶血性贫血可分为四种主要类型：
1. 直接抗球蛋白试验 补体是红细胞上唯一能被检出的蛋白。多
特异性抗球蛋白试剂中抗C3d（C4d）成分是 造成DAT阳性的原因。
2．血清
在 4℃ 温 度 测 定 与 免 疫 性 溶 血 有 关 的 IgM冷反应性自身凝集素效价常大于1，000 以上；在体外用超过32℃温度盐水悬浮红细 胞时则很少有反应。若在反应介质中加入 30%牛白蛋白时，70 % 有临床意义的样本 将在37℃反应
人球蛋白试验中都呈阳性反应。血清中的游离抗 体量非常少。
3、放散液中
体。 4、自身抗体特异性
可检到IgG抗
冷凝集素综合征（CAS）
CAS（也称冷凝集素疾病CHD)，是与 冷反应自身抗体有关的溶血性贫血中最常见 的一种类型，约占所有免疫性溶血性病例的 16-典型的血清学特征
3、 血清里存在游离的自身抗体时，不可能获 得在血清学上完全相配合的血液。这种情 况下要考虑自身抗体可能掩盖有临床意义 的同种抗体的存在。倘若时间允许，在输 血前应测定是否存在同种抗体
解决ABO定型中的问题
1 、采集标本后，立即将标本放入37 ℃并在试 验前用温盐水（37~45 ℃ ）洗涤红细胞。
2、血清免疫球蛋白类型 在PCH中IgG自身抗体，习惯上称为双相
性溶血素，因为它在低温与红细胞相结合，在 37℃ 时 使 致 敏 红 细 胞 溶 血 。 Donath— Landsteiner(DL)试验是诊断这种疾病的基础。
3、释放液免疫球蛋白类型
由于补体成分是循环红细胞上唯一存在的 球蛋白，因此从PCH病人红细胞上得到的洗脱 液一般是没有活性的。
非抗体介导的丙球蛋白过高患者
直接抗人球蛋白试验阳性的评价
血液标本的收集 初步的血清学研究 进一步的研究
自身免疫性溶血性贫血
一、概念
▪ 免疫性溶血 免疫性溶血是指由于免疫反应而使红细
胞破坏加速，寿命缩短的过程。
▪ 溶血性贫血 溶血性贫血是由于红细胞破坏增多、增
速， 超过造血补偿能力范围，所发生 的一种贫血。