(优选)色谱柱选择与维护保养安捷伦科技
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反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
柱填料基质
高或低pH下, 硅胶会溶解 • 硅胶基质- pH 3~8 化学修饰困难 • Al2O3 . nH2O - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有• 聚合物基质 - pH1~14
1页
（优选）色谱柱选择与维护保养安捷 伦科技
Agilent Technologies
安捷伦HPLC色谱柱选择
分离模式的选择
溶于正己烷
溶于有机溶剂
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
分子量<2, 000
溶于四氢呋喃
样品
溶于水
非离子化 离子化
分子量>2, 000
பைடு நூலகம்
溶于有机溶剂 溶于水
用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式
不规则形
1.8µm 3.5µm
5µm
7µm
10µm
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形
样品 MW 4, 000, 选择 80Å 的孔径 样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
大孔径填料适用于大分子分析
* 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
* Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
C-18柱---性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起 来
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅
ZORBAX®生产工艺
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 +
脲 (pH=2) +
甲醛CH2O
D 250oC O2
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸
流速: 0.75 mL/min
O
温度: RT
CH3 CHO
分子量虽小但 hydrodynamic volume (水动力学体积)较大的分子
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
球形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得
最佳峰形
PW 1/2
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
0.20
0.18
300SB-C18 (300Å)
0.16
SB-C18 (80Å)
用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
检测器: UV 282 nm
H3C
HO
O O CH2
H3C O
OCH3 OCH3
CH2 O
CH2
HOH3C N CH3
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
柱填料基质
高或低pH下, 硅胶会溶解 • 硅胶基质- pH 3~8 化学修饰困难 • Al2O3 . nH2O - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有• 聚合物基质 - pH1~14
1页
（优选）色谱柱选择与维护保养安捷 伦科技
Agilent Technologies
安捷伦HPLC色谱柱选择
分离模式的选择
溶于正己烷
溶于有机溶剂
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
分子量<2, 000
溶于四氢呋喃
样品
溶于水
非离子化 离子化
分子量>2, 000
பைடு நூலகம்
溶于有机溶剂 溶于水
用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式
不规则形
1.8µm 3.5µm
5µm
7µm
10µm
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形
样品 MW 4, 000, 选择 80Å 的孔径 样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
大孔径填料适用于大分子分析
* 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
* Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
C-18柱---性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起 来
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅
ZORBAX®生产工艺
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 +
脲 (pH=2) +
甲醛CH2O
D 250oC O2
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸
流速: 0.75 mL/min
O
温度: RT
CH3 CHO
分子量虽小但 hydrodynamic volume (水动力学体积)较大的分子
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
球形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得
最佳峰形
PW 1/2
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
0.20
0.18
300SB-C18 (300Å)
0.16
SB-C18 (80Å)
用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
检测器: UV 282 nm
H3C
HO
O O CH2
H3C O
OCH3 OCH3
CH2 O
CH2
HOH3C N CH3