色谱柱活化和保养

切忌用缓冲盐保存色谱柱 反相柱：100%甲醇或乙腈 正相柱：异丙醇或正已烷 离子交换柱： 100%甲醇，或大于40%的有机相
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C18色谱柱清洗和再生
• 每天柱子使用完后,立刻冲洗，如果使用缓冲液，必须先用相同比例的有 机相/水冲洗20个柱体积，然后再转换到100%有机相，冲洗20个柱体积
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内容
• • • • 新色谱柱活化 色谱柱日常使用保养 色谱柱日常保存 色谱柱清洗和再生
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新色谱柱活化
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使用新的C18色谱柱时,用甲醇或乙腈冲洗20-30个柱体积，然后用甲醇/ 乙腈：水（50：50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡10-30柱体 积 使用新的正相色谱柱时，用流动相平衡20-30个柱体积。 Thermo 部分品牌的氨基柱和氰基柱是保存在正相流动相中，用于反相 色谱时，请先用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积 当用HILIC 模式时，新柱用50倍柱体积50/50 乙腈/水活化和平衡，然后 再用流动相平衡20个柱体积 离子色谱柱（SAX,SCX):新柱先用100%甲醇/或乙腈冲洗20个柱体积， 然后转换到流动相平衡
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色谱柱日常使用保养
•避免问题的 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相 /离子性流动相中有一定的溶解度） “秘诀” •大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2 - 8.0 •避免流动相组成及极性的剧烈变化 •使用HPLC级试剂，流动相使用前必须经脱气和过滤处理
•如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净， 并保存在乙腈中
出现“鬼峰”
样品中未知的组分 色谱柱被污染
溶剂中有杂质 流动相和溶解样品的溶剂不互溶
三氟乙酸被氧化
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色谱常见故障排除
出现肩峰或 前延峰
可能原因
预柱被污染或选用了不合适的预柱 柱头“塌陷”造成死体积
解决办法
更换预柱 更换色谱柱
溶解样品的溶剂选择错误
用流动相溶解样品，如果不可以，应将 进样体积降至很低（如1微升）
可能原因
样品体积过大； 色谱柱过载
溶解样品的溶剂选用不当
解决办法
减少进样体积； 稀释样品； 将样品在流动相中溶解；如果不行， 尽可能将进样体积降低（如1微升） 更换色谱柱； 使用较温和的分离条件 更换色谱柱的滤网； 使用柱前过滤装置； 过滤样品 彻底清洗进样器； 更换进样器转子
色谱柱有“塌陷”、短流或断流
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色谱常见故障排除
基线漂移
锯齿状基线 流动池中有气泡 灯接近使用寿命 小波基线 流动池中有气泡 温度波动 漂移 梯度洗脱 平衡时间不够长 色谱柱键合相或硅胶溶解 温度缓慢变化
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色谱常见故障排除
压力高 压力高
预柱堵塞 柱头堵塞 更换预柱 更换柱头的滤网；反向冲洗柱子； 更换色谱柱 更换管路
可能原因
柱外效应的影响
检查毛细管连接
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色谱常见故障排除
可能原因
峰形展宽
色谱柱“过载”或进样体积过大 溶解样品的溶剂选用不当 缓冲溶液的浓度太稀
解决办法
减少进样体积；稀释样品
用流动相溶解样品 使用浓度稍高的缓冲溶液或者 换用其它的缓冲溶液 检查毛细管连接 检查是否有漏；使用小的检测池
柱外效应的影响 色谱柱和检测器之间有漏； 检测器的检测池过大 色谱柱温度太低； 流动相的黏度太高 连接用的毛细管太长； 柱外死体积太大 色谱柱柱效下降
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色谱常见故障排除原则
•避免问题
•确定问题所在！
•一次仅改变一种因素! • 将处理问题的时间降到最低 •确保同样的问题发生过至少两次! • 预测可能出现的问题 •对故障排除工作作好记录!
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色谱柱滤网堵塞
进样器没有彻底清洗
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色谱常见故障排除
保留时间不稳定
可能原因
流速变化
解决办法
检查系统是否有漏； 更换泵的密封圈； 排净气泡； 保持流动相pH值在2-7.5 范围内 检查泵；检查滤网； 防止流动相的挥发或降解
键合相流失
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流动相的组成有变化
温度变化
使用色谱柱恒温箱
色谱柱未完全平衡
平衡好色谱柱
• 再生： 用100%水，甲醇，三氯甲烷，甲醇， 100%水分别冲洗20个柱体积，在第 一次用100%水 时，进样5次200ul二甲亚砜DMSO。
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正相色谱柱的清洗和再生
• 再生： 用四氢呋喃，甲醇，四氢呋喃,二氯甲烷，正己烷， 分别冲洗20个柱体积，
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离子色谱柱的清洗和再生
• 每天冲洗保存： 用 100% 水冲洗30个柱体积去除盐，，然后用100% 甲醇/或乙腈冲洗20 个柱体积后保存在50% 甲醇/或乙腈中 • 再生方法： • 建议：先用高浓度盐的缓冲液清洗（浓度可以是5-10倍，不超过1M）， 然后再用100%水洗，100%乙腈（或甲醇）清洗，再用50%乙腈或甲醇 保存。
干扰峰；杂质
使用流动相改性剂（如三乙胺）； 硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响提高缓冲溶液或盐溶液的浓度（离子对色谱） 降低流动相的pH值； 使用碱性去活的色谱柱
色谱柱的滤网堵塞
更换滤网；使用柱前过滤系统； 将样品过滤
色谱柱有“塌陷”
更换色谱柱； 使用性质较温和的分离条件
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色谱常见故障排除
出现双重峰或 分叉峰
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溶剂
溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度方法 溶剂纯度的影响
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溶剂
溶剂混合产生的问题 流动相中所使用的不同溶剂必须互溶
流动相中溶剂不互溶会导致: 1. 基线漂移， 2. 保留时间的重现性差， 3. 出现肩峰和“鬼峰”的问题.
注意： 过高浓度的磷酸盐缓冲溶液可能会在有机溶剂中析 出
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色谱柱的日常保存
• • • •
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新柱测柱效
•
建议新色谱柱按COA 报告测试柱效 例如：C18 测试柱效方法：
测试液的配制方法：邻-二甲苯（600ul）溶于 100 ml 流动相中. 萘 50 mg，溶于100 ml流动相 流动相：60/40 乙腈/水 流速：1.25 mL/min 检测波长：254 nm 进样体积：3.0 uL
解决办法
管路堵塞
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色谱常见故障排除
可能原因
上一针样品中没有完全流出的物质
解决办法
待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品； 每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱； 改进样品的预处理；组分复杂的样品尽可能使用 梯度方法 改进样品的预处理 每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱； 改进样品的预处理 使用色谱纯的溶剂 尽可能用流动相溶解样品 流动相尽量每天新配；使用三氟乙酸时，应 使用抗氧剂
色谱柱活化和保养
Thermo Fisher Scientific 金琦芸
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Thermo CCS 部门介绍
• ThermoHypersil-Keystone的前身是成立于1976年,并且是世界知名的液相 色谱柱和液相色谱填料的专业公司Hypersil公司,所生产的创新型分离材料 在国际市场得到了广泛的应用。 • 随着时间的推移，Hypersil成为了Thermo Electron公司的一部分,并在2000 年顺利地收购了Keystone 公司现在正式的成为了ThermoHypersilKeysone公司。产品包括液相色谱柱，气相色谱柱，样品瓶和固相萃取小 柱等等。
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色谱常见故障排除
负峰
解决办法
可能原因
流动相中有比分析物 更强紫外吸收或折光 指数的物质
调整检测波长，改变流动相组成
流动相与样品溶剂折 光指数有很大差别
用流动相溶解样品
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正相色谱常见故障排除
解决方案 峰型变型 重现性差 调整进样溶剂极性，相同于流动相 对于硅胶柱，加入预用水平衡的流动相或0.1%-0.5%甲醇 用键合性硅胶柱（NH2,CN, Diol）
提高色谱柱温度 使用内径较细的较短的毛细管连 接； 检查柱外死体积 使用较小粒径填料的色谱柱； 更换色谱柱
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色谱常见故障排除
可能原因 解决办法
减少样品体积； 增大色谱柱内径； 使用高容量的固定相 改进样品预处理； 调节流动相的组成； 使用测试样品混合物检查色谱柱； 使用色谱纯溶剂
出现脱尾峰
色谱柱过载
•压力升高是需要更换预柱的信号 •确认流动相中缓冲盐的溶解性 •确认样品在流动相中的溶解性 •避免压力的突变
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溶剂
使用不脱气或脱气不完全的流动相会导致形成气泡、泵性能不稳定、检测器噪 音高以及其它检测器故障 流动相脱气
120 100 80 60 40 20 0
Heating Helium Vacuum Ultrasonic