五羟甲基糠醛

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内的转化、脱水、贮存至成熟的过程而形成的天然甜物质[1]。蜂蜜作为食品历史久远。最早的养蜂可追溯至1.5万年前的旧石器时代。1919年在西班牙东部名为瓦伦西亚(Velencia)小城的Cucvas de La Arana石窟壁上，发现刻有攀藤采蜜风光的最古老记载。在埃及金字塔上的象形文字中刻有蜂蜜的食用和医用方法。“蜜月”一词是因日耳曼民族的生活习惯而创造的词语，据说是指新婚夫妇在结婚后一个月期间内，共饮蜜酒(用蜂蜜经发酵后制作成的酒)，以度甜蜜的生活。我国食用蜂蜜的历史，最早可追溯到殷商纣王时代。公元前11世纪，在殷墟甲骨文中就有“蜜”字。在我国历代医药古书如《神农本草经》、《伤寒论》、《抱朴子》、《肘后备急方》、《药性论》和《本草纲本》中，大多记载有蜂蜜的药用和功效，说明我国在两千多年前就开始服食和使用蜂蜜了，并且将蜂蜜列为药中的“上品”。
几千年来蜂蜜经久不衰，这与蜂蜜所包含的多种独特的营养成分有关。蜂蜜主要成分是可被人体直接吸收的葡萄糖(25.2–35.3%)和果糖(33.3–43.0%) [2-4]，两者含量合计可达70–80%；各种氨基酸，包括在人体内不能合成的8种必需氨基酸；与人体血清中含量几乎相近的二十余种矿物质；多种促进人体生长和代谢的维生素；多种活性酶。蜂蜜的成分因蜜蜂采集的蜜源植物及气候环境不同而有一定的差别。
蜂蜜以其香甜圆润的独特风味、丰富的营养和良好的保健功能而成为人们喜爱的传统保健食品。欧洲、北美和部分亚洲国家视蜂蜜为“药用食品”。李时珍在《本草纲目》中记载，蜂蜜具有清热、补中，解毒、润燥和止痛之功能。现代医学研究证明，蜂蜜具有多种保健功能[5-8]，表现在：蜂蜜有缓泻作用，对胃肠功能有调节作用，有使分泌正常化的作用；蜂蜜具有消炎、杀菌、润肤和促进伤口愈合的作用[9]，可用于治疗感染性创伤、烧伤和冻伤等疾病；蜂蜜的最新用途是对移植用皮肤的保存；由于蜂蜜的主要成分是单糖(果糖与葡萄糖)，极易被人体吸收，故能迅速消除疲劳；蜂蜜有营养心肌、改善心肌代射过程、调节心脏功能并使其正常化的作用，其有效成分可能是其所含的大量糖和许多其它营养物质，如氨基酸、酶和维生素；蜂蜜还具有增强免疫能力及抗肿瘤作用。
蜂蜜是世界上唯一能保持美味可口而不易腐变的天然食品，对人体有显著的医疗保健作用，故已被广泛用于医药、食品、饮料和化妆品等行业以及进入人们日常的家庭消费中。世界蜂蜜产量呈缓慢的上升趋势，2004年的产量

约为135万吨，较1984年的近100万吨增长35.24%。蜂蜜的需求量增长明显快于产量的增长且呈逐年增长态势。世界蜂蜜进口贸易量在2003年约为40万吨，较1984年的近26万吨上升55.06%。蜂蜜主要的消费国是美国、德国、东欧和日本，而蜂蜜的主要生产国为阿根廷、巴西、中国、土耳其、俄罗斯和墨西哥等[10,11]。由于蜂蜜产量有限，且易受到天气变化、植物花期长短和蜜蜂生长状况等因素的影响，故蜂蜜产量常出现不稳定的波动，从而使国际蜂蜜价格常出现较大的波动且蜂蜜价格时常高企。因此，几十年来蜂蜜一直为不法投机者掺杂的重要目标之一。蜂蜜资源的有限性与逐年急剧增加之市场需求间的矛盾使蜂蜜价格一直高企，致使一些不法个人与厂商以次充好，或往天然蜂蜜中掺入各种低廉的物质制造掺杂蜂蜜以获得高额利润。大量品质低劣的掺杂蜂蜜以天然蜂蜜的名义投放市场，坑骗消费者以获取暴利，严重侵害了天然蜂蜜产品的商誉，扰乱了蜂蜜的市场秩序并使之陷入了前所未有的困境。国内的蜂产品因此也曾一度在品质上失控。国外各蜂蜜进口国认为我国蜂蜜的品质低劣，只肯以低价交易，严重损害了我国蜂产品在国际市场上的信誉，削弱了其在国际市场上的地位和竞争力[11]。蜂蜜的掺杂问题是我国当前蜂蜜市场上存在的一个极为严重的问题，如何监控蜂蜜产品的品质以及如何鉴别蜂蜜产品掺杂已成为我国蜂蜜产业亟待解决的重要问题。当前在蜂蜜品质监控研究中还存在陈蜜检验和C3糖掺杂鉴别等方面尚未解决的技术问题。故亟需发展新的更灵敏的蜂蜜掺杂检验技术，为政府部门维护市场秩序、保护消费者权益提供技术支撑。

1.2 蜂蜜掺杂的主要形式及掺杂鉴别的研究现状

天然蜂蜜的主要成分是糖类物质，其中果糖和葡萄的含量最高，各占蜂蜜的30–40%，合计单糖占蜂蜜的70–80%。还有少量的蔗糖、麦芽糖和多聚糖等，故蜂蜜被称为“高度浓缩的糖浆”。
蜂蜜掺入物主要包括淀粉、糊精、蔗糖、转化糖、果糖和葡萄糖等。由于价格低廉的高果糖玉米糖浆(HFCS)产量大及其主要成分类似于蜂蜜中的糖，均由果糖和葡萄糖组成，所以高果葡糖浆已成为现时最主要的蜂蜜掺杂物。也有以转化糖、高果葡糖浆和葡萄糖浆为主要原料，再添加增稠剂、蜂蜜香精和色素等添加剂而制造假蜂蜜的情形。这些掺杂蜂蜜或假蜂蜜产品在感官指标和部分理化指标上与天然蜂蜜产品极为相似，部分掺假蜂蜜甚至以先进的鉴别技术也难以辨别真伪。
在中国最初的蜂蜜掺杂形式是在天然的蜂蜜中简单地掺入水、蔗糖、转化糖、饴糖、羧甲基纤维素、糊精或淀

粉类物质[12,13]。此类掺杂蜂蜜在感官指标上天然蜂蜜有明显的差异，如味淡、色泽变化、结晶、香气变淡等。可用简单的物理或化学方法进行真伪鉴别。如：
(1) 蜂蜜中饴糖的检测：取待检蜂蜜产品1份，将其置于试管中，再加水4份，使其成为稀溶液，逐渐加入浓度为85%的酒精，如有饴糖掺入，则会形成较多的白色絮状物。
(2) 蜂蜜中蔗糖的检测：取待检蜂蜜产品1份，加水稀释后，将硝酸银滴于其稀溶液中，若出现絮状物，则说明在该产品中掺入了蔗糖。
(3) 蜂蜜中掺面粉、糊精或其它淀粉的检测：取待检蜂蜜产品2 g，加净水20 mL，煮沸并让其冷却后，加入碘液2滴，如呈蓝色、绿色或红色，则证明在该产品中有淀粉类物质的掺入。
(4) 蜂蜜中羧甲基纤维素钠盐的检验：取待检蜂蜜产品10 g，加20 mL浓度为95%的乙醇，混匀，即有白色絮状物析出；取白色絮状物2 g，将其置于100 mL温热的蒸馏水中，摇匀，冷却备检；再进行A和B两项检验，即：(A) 取上述溶液30 mL，加3 mL盐酸，如产生白色沉淀，则为阳性；(B) 取上述溶液50 mL，加100 mL 1%的硫酸铜溶液，如产生绒毛状淡蓝色沉淀，则为阳性；若上述两项试验均出现阳性结果，说明在该待检的蜂蜜产品中掺有羧甲基纤维素钠盐。然而，现今这些掺杂物已很少大量使用，取而代之的是葡萄糖、葡萄糖浆和果葡糖浆等。由于葡萄糖和果糖是天然蜂蜜的主要成分，故掺入这些糖后的蜂蜜风味不但没有被破坏，而且有些理化指标还得到强化。这些掺杂物具有很大的隐蔽性，用常规方法难以检测，也对蜂蜜的常规掺杂检测构成了新的挑战。

早在上世纪50年代国外就开始对鉴别蜂蜜掺杂的检测方法和技术开展研究。蜂蜜
掺杂的检测方法主要有三类：第一类是检测掺入物中特有的而纯蜂蜜中没有或处于很低水平的特征成分，从而确定蜂蜜是否掺杂；第二类是检测出纯蜂蜜中某些成分处于一定水平，当掺入其它后其水平会低于某一特定值；通过分析特征成分的含量变化，从而确定蜂蜜是否掺杂以及掺杂量；第三类是采用现代检测技术分析蜂蜜中某些指标的变化，再根据指标变化估算出掺杂量。

第一类方法中包括羟甲基糠醛(HMF)和多糖的检测。HMF是转化糖的副产物。研究者通常将HMF作为转化糖掺入的鉴别指标[13,14]。天然蜂蜜中含有微量的HMF。在蜂蜜中掺糖会引起其HMF含量的显著增加。通过检测蜂蜜中HMF的含量就可知悉转化糖的掺入量。但蜂蜜在热加工过程中，随着温度的升高和加热时间的延长，蜂蜜中HMF的含量会逐渐增加。在相同条件下，不同种类的蜂蜜其HMF的含量变化也存在较大差异[15]。由于陈年蜂蜜中HMF

的含量也会随存放时间的延长而增加[16]，故将HMF作为转化糖掺入的鉴别指标曾遭到质疑。美国原来使用纸层析法(31.134-31.136)来测定蜂蜜中果糖，后来由Kushnir与White提出了改进措施[17,18]：先用硅藻土–碳柱将蜂蜜中的单糖和双糖除去，再将得到的多糖用薄层色谱(TCL)进行展开，若Rf > 0.35，且仅有一个或二个蓝色斑点，则指示待测样品为纯蜂蜜；若有多个蓝色斑点，则指示待测样品为掺入高果葡糖浆(HFCS)的掺杂蜂蜜。改进的薄层色谱(TCL)法大大缩短了检测时间并明显提高了灵敏度 (检出限为10%)，取代了原来官方测定蜂蜜中果糖的方法中的色谱部分(31.136)并被广泛用于检测蜂蜜的品质。

显微分析(Microscopic analysis)[19,20]和花粉分析(Pollen Analysis)曾作为检测蜂蜜中可见的外源掺杂物如淀粉粒、蔗糖和蔗糖产品或其它蜜源蜂蜜的有效方法[21]；但是随着微滤技术的发展，人们已能彻底除去蜂蜜中某些重要的标记物如蔗糖中夹带的硬质皮屑、外皮细胞及外源蜜种中的花粉粒，致使该方法对蜂蜜中是否掺入蔗糖或其它蜜源的蜂蜜难以作出正确的判识。

第二类方法侧重对蜂蜜中糖类进行检测，通过确定被检测物的含量及其比例变化来判识蜂蜜是否掺杂。研究表明，蜂蜜中除单糖(葡萄糖和果糖)约占总糖的90%外，其它糖类还有20余种[22-25]，其中11种为二糖和11种为三糖。蜂蜜中糖的种类及其含量是蜂蜜品质的重要指标。目前，有关蜂蜜中糖的测定方法很多。常用的有气液色谱(Gas–liquid chromatography, GLC)[26-27]、高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)[22,24-25,28-29]和薄层色谱(Thin layer chromatography, TLC)[17-18]。
气液色谱(GLC)：高度灵敏(可达4 ? 10?8)的氢火焰离子检测器(FID)被广泛应用于碳水化合物的分析。但GLC分析糖类存在两个缺点[30]：一是因某些糖有互变异体(Tautomeric form)，从而出现多峰现象；二是糖为非挥发性物质，在进行GLC分析前必须先衍生化，但大多数单糖在衍生化后会出现多峰现象，从而影响其测定精度。
高效液相色谱(HPLC)：由于该方法所需样品的量很少，且待测物被分离后可进一步分析，故HPLC已被广泛用于碳氢化合物的分离和定量。近年来国外对蜂蜜的成分研究表明，蜂蜜中存在微量的生物活性物质；不同的单花蜂蜜其特征成分存在明显的差
异。曹炜等[31]采用HPLC指纹图谱技术，研究了不同种类蜂蜜中微量的生物活性物质和非活性物质，不但能有效区分不同蜜源的蜂蜜，并且还可用于蜂蜜的品质监控，尤其是鉴别蜂蜜种类及判识蜂蜜是否掺杂。用带脉冲电流检测器的阴离子交换液相色谱能检测出蜂蜜中是否掺入高果糖玉米糖浆和转化

糖浆。采用HPLC方法可检测蜂蜜中麦芽糖与异麦芽糖之比例并据此可确定蜂蜜是否掺入糖浆[14,30]。然而，用HPLC检测蜂蜜中糖类物质也存在某些不足，如蜂蜜中单糖(葡萄糖和果糖)的含量及其比例会随蜜源不同而在某一范围内变化，故难以检测葡萄糖和果糖的低比例掺杂。
蜂蜜中二糖的结构多样[22,24]，或是葡萄糖–葡萄糖(麦芽糖)或是葡萄糖–果糖(蔗糖)。二糖的含量很低，约占蜂蜜的1%；而多聚糖的含量则更低。待检样品的浓缩增加了HPLC对蜂蜜中糖类物质的检测难度。新型检测器如电化学检测器(Electrochemical detector, ECD)和质谱检测器(Mass spectrometry detector, MSD)等的出现也只能部分解决用HPLC检测蜂蜜中糖类物质的问题。
其它可用于蜂蜜掺杂检测的现代检测技术还很多，如中红外光谱(Midinfrared spectroscopy, MIR)[32-34]、傅里叶变换拉曼光谱法(FT–Raman spectroscopy)[35,36]、高效离子交换色谱-脉冲安培检测器(High performance anion exchange chromatography–pulsed amperometric detection, HPAEC–PAD)[37]、示差扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry, DSC)[37-39]和核磁共振(13C–NMR)[24]，等等，但这些方法均因存在灵敏度等方面的限制，而目前仍处于研究阶段，未能得到广泛应用。
由Whiter提出的稳定碳同位素比值法(SCIRA和ISCIRA)属于第三类方法。20世纪50年代，美国的Calvin及其同事用14C标记和纸层析技术发现并阐明了C3循环[40]。1967年澳大利亚科学家Hatch & Slack[41]发现了新的CO2固定途径即C4循环。1971年，Bender，Smith和Epstein[42-43]报道了高等植物的不同光合作用途径(特别是酶反应)在稳定碳同位素上具有生物歧视效应，并使12C和13C的比值出现微小的但可检出的差异。前人研究发现[42,44]，C3植物的?13C值范围为?22‰ ~ ?33‰，C4植物的?13C值在?10‰ ~ ?18‰范围变化；而具有CAM光合循环途径的植物，其?13C值介于C3和C4植物之间，在?14‰ ~ ?31‰范围变化。Doner & White[45]利用不同来源的碳水化合物的?13C值差异，以质谱仪测定其?13C值，采用稳定碳同位素分析(Stable Carbon Isotope Ratio Analysis, SCIRA)技术解决了蜂蜜掺杂鉴别的技术难题。
White & Doner发现[46]：几乎所有的蜜源植物属C3植物，其?13C值约在?28‰ ~ ?22‰范围，而自然界在该范围之外的蜜源植物却寥寥无几。C4植物的?13C值在?20‰ ~ ?10‰范围变化[47]。C3和C4植物所形成的碳水化合物在化学结构上是相同的，但其?13C值却存在明显差异。当将两类碳水化合物混合时，该混合物的?13C值则随两类碳水化合物的比例变化而改变。据此就能有效区分C3与C4植物来源的碳水化合物，这是普通化学法难以实现的。这就是稳定碳同位素示踪技术鉴别蜂

蜜中是否掺杂高果糖玉米糖浆的技术原理。White & Doner[46]用质谱仪测定了来自37种蜜源植物的84种蜂蜜的?13C值，发现这些蜂蜜的?13C值平均为–25.2‰。甘蔗糖浆和高果糖玉米糖浆(HFCS)源于C4植物。测得甘蔗糖浆的?13C值为–11.47 ? 0.5‰，而高果葡糖浆的?13C值为–9.7‰。当在蜂蜜中掺入高果葡糖浆时，该混合物的?13C值则随其掺入量的变化而改变，掺入越多，?13C值越大。利用该技术，Doner &White[45]不仅分析了500多个来自不同国家或地区的纯蜜样品，而且还检测了大量的人工制备的掺入不同比例高果糖玉米糖浆的蜂蜜样品。通过对分析结果的统计分析，得出如下结论：?13C值小于?23.5‰的蜂蜜为未掺杂的纯蜜；?13C值大于?21.5‰的蜂蜜为掺杂的蜂蜜；?13C值落于?23.5‰至?21.5‰区间的蜂蜜既可能为纯蜜，也可能存在掺杂。该方法于1987年被国际AOAC组织批准为国际AOAC标准方法，方法代号为AOAC 978.17[48]。
SCIRA 方法解决了?13C值小于?23.5‰的纯蜜和大于?21.5‰的掺杂蜂蜜的检验，但对于那些?13C值处于?23.5‰至?21.5‰区间的“灰色区”的蜂蜜，SCIRA 方法对确定其是否掺杂却无能为力。后来，White对该方法作了改进[49,50]，即以蜂蜜中另一重要成分––蛋白质的稳定碳同位素作内标物，将蛋白质的?13C值减去全蜜的?13C值得到一差值，该差值称为ISCIRA指数(ISCIRA Index)。当ISCIRA指数为?1‰时，蜂蜜中含7%的C4糖。该指数越负，说明蜂蜜中掺入C4糖(即高果糖玉米糖浆)的量越多。该方法被称为蜂蜜内标碳同位素比值检验方法(Internal Standard Carbon Isotope Ratio Analysis, ISCIRA)。该方法于1991年被国际AOAC组织采纳为国际AOAC方法，代号为AOAC 991.41[48]。
蜂蜜中C4糖的掺杂量(Adulteration percentage, AP)可根据如下公式估算：
AP (%) = {(?13CP ? ?13CH) / [?13CP ? (?9.7)]} ×100 (1–1)
在(1–1)式中，AP为蜂蜜中C4植物糖的百分含量；?13CP为蜂蜜中蛋白质?13C值；?13CH为蜂蜜?13C值；?9.7为玉米糖浆的平均?13C值。
若计算结果为负值，则C4糖的含量按0计；当计算结果大于或等于7%时，则指示该待检蜂蜜样品掺杂了C4糖。
AOAC 978.17和AOAC 991.41这两种标准方法已被世界各国广泛采纳作为蜂蜜品质监控的常规手段。欧美国家还将这两种标准方法列为进口蜂蜜的强制检验项––常规项目和反欺诈项目。
近年来，稳定碳同位素技术在蜂蜜品质研究中得到了广泛的应用和发展。Martin et al.[51]利用稳定碳同位素方法测定了49个蜂蜜样品，提出先以半乳糖氧化酶处理蜂蜜中的多糖组分，再测定具有半乳糖结构的多糖(BG)含量的方法；该方法可以用于鉴别蜂蜜中是否有C3糖(

如甜菜糖)的掺杂。Padovan[52]用GC/MS–ISCIRA方法测定了产自巴西、美国和加拿大等国的蜂蜜样品，得出的认识与White 于1992年的研究[50]结论一致。Cabaňero et al.于2006年提出HPLC–IRMS方法[53]，即用HPLC方法分离蜂蜜中的果糖和葡萄糖并测定其?13值，通过??13C [fruct–glu]/??[glu–suc]比值可有效检出低比例(1–10%)C4糖或C3糖(如甜菜糖)的掺杂。
稳定碳同位素方法是根据植物光合作用途径(特别是酶反应)的不同造成碳稳定同位素的生物歧视效应；通过检测12C与13C之比值间微小的但可检出的差异来判识是否有C4糖的掺入，检出水平为7%。显然，若在蜂蜜中掺入C3糖如甜菜糖，或添加由C3植物如水稻和薯类为原料生产的果葡糖浆、葡萄糖浆或果糖浆，则该方法将无法检出。故单独采用该方法无法检出C3糖的掺杂及掺杂比例小于7%的C4糖的掺杂。
此外，由于陈蜜中存在少量的微生物，它们能使蜂蜜产生缓慢的酶解而逸出CO2，从而造成陈蜜的?13值发生微小的变化。据黄伟坤等报道[54]，单独采用稳定碳同位素方法对陈蜜(特别是贮存温度较高的陈蜜)的掺杂进行检测，往往会出现误判。因此，以稳定碳同位素比值法为主线，结合蜂蜜中主要和次要成分的分析，将明显提高蜂蜜掺杂判识的可靠性，有效避免误判。

1.3 本文的研究方法及拟解决的科学问题

十多年来，国外主要应用稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)和内标碳同位素比值分析法(ISCIRA)对蜂蜜品质进行监控。我国出口蜂蜜常被进口国要求提供稳定碳同位素比值的检测报告。迄今为止，尚未见到有关采用SCIRA/ISCIRA方法检测国内市场销售的蜂蜜掺杂情况的报道。本研究以广州市售蜂蜜为研究对象，采用SCIRA/ISCIRA方法对其进行检测，为国内市场销售的蜂蜜商品提供首批稳定碳同位素比值数据，阐明国内市场销售的蜂蜜商品的品质现状，为政府部门维护市场秩序，保护消费者权益提供强有力的技术支持。
蜂蜜中糖的稳定碳同位素数据在文献中未见报道。本研究采用化学方法将蜂蜜中的糖和蛋白质分离，再采用EA-IRMS技术测定全蜜、糖和蛋白质样品的稳定碳同位素比值，探讨全蜜、蛋白质和糖的稳定碳同位素比值之间的关系。

1.4 主要研究内容和取得的主要成果

本文以广州42个市售的、标识了“纯蜂蜜”的单一花蜜为主的蜂蜜商品为研究对象，先将蜂蜜中的蛋白质和糖分离，然后采用EA–IRMS技术分别测定全蜜及其蛋白质和糖的?13C值。研究结果显示：
(1) 全蜜的?13C值在在?15.0‰ ~ ?27.0‰之间变化，其中30个蜂蜜样品(占71.4%)全蜜的?13C值小于?23.5‰，指示它们为纯蜂蜜；而有2个蜂蜜样品全蜜的?13C值大于

?21.5‰，表明其存在掺假；10个蜂蜜样品全蜜的?13C值在?21.5‰ ~ ?23.5‰之间变化，正落于SCIRA法难以作出有效判识的“灰色区”。
(2) 蛋白质的?13C值?20.3‰ ~ ?26.4‰之间变化，平均值为?24.0‰。采用ISCIRA法对全蜜?13C值落入“灰色区”的蜂蜜样品作进一步判识研究。以这些蜂蜜样品中蛋白质的?13C值为内标，按照掺杂量(%) = [(?13CP – ?13CH) × 100] / [?13CP – (–9.7)]的公式计算，结果表明，在?13C值落入“灰色区”的蜂蜜样品中又识别出2个掺假的蜂蜜样品。
(3) 综合SCIRA法与ISCIRA法对所抽取的42个蜂蜜样品，4个即9.52%被判识为掺假蜂蜜。
(4) 全蜜与糖的?13C值大小与分布十分相似，回归方程为：Y = 0.01845 + 1.003 X，R2 = 0.9942，说明占绝对含量的糖对蜂蜜的物理化学性质有重要的作用。
(5) 稳定碳同位素方法是一种高灵敏的判识蜂蜜掺杂的现代分析技术。SCIRA与ISCIRA的结合可显著提高鉴别蜂蜜掺杂的能力。


2. 原理及方法


2.1 原理

2.1.1 稳定同位素基本理论[55]
原子由原子核和核外电子构成；而原子核由质子和中子组成。一个原子核可以用下列数字特征表示：A = Z + N，式中Z为质子数，N为中子数，A为总核子数。质子数相同而中子数不同的原子称为同位素(Isotope)。由于核外电子数由原子核中的质子数决定，故相同元素的同位素具有基本相同的性质。
同位素分为放射性同位素(Radioactive Isotope)和稳定同位素(Stable Isotope)两类。凡能自发地释放出粒子并衰变为另一种同位素者为放射性同位素。稳定同位素指无可测放射性的同位素。大部分稳定同位素是天然成因的，即自核形成以来一直保持稳定的同位素，如H与D、13C与12C、18O与16O和34S与32S。
同位素常以相对丰度(Isotope Abundance)来表示。当原子序数Z < 20时，某元素通常有一种同位素(一般是最轻的同位素)具有最高的相对丰度，其它同位素的丰度都很低，如12C = 98.90%，而13C = 1.10%。不同研究对象的稳定同位素丰度是不同的。同位素分馏(Isotope fractionation)是自然界中引起稳定同位素丰度改变的主因之一。
碳是重要的生命元素，自然界有两种稳定碳同位素：12C与13C (12C 占 98.90%，而13C占1.10%)。不同的物质(有机体、矿物)中，由于同位素效应(Isotope effect)即参加反应的物质因重和轻同位素的不同而产生差异的作用，两种碳同位素的丰度比(R = 13C/12C)是不同的。轻(13C)、重(12C)两种同位素具有微小差别的物理化学性质，如气相、液相中的传导速率、化学键能强度、参与化学反应的速度以及生物过程中，体系的不同部分，如反应物和产物的同位素组成会发生微小的、但可测量的变异，因而使得12C与13C在碳元

素的生物地化循环中发生稳定碳同位素的分馏。
质谱法是目前最有效的测定同位素丰度的方法。质谱计一般分四个部分：进样系统、离子源、离子偏转装置或质量分离器和离子检测器。用质谱仪测定同位素比值常用?值表示，单位为千分数(‰)。?值定义为：
? (‰) = [(R样品 ? R标准) × 1000]/R标准 (2–1)
在(2–1)式中，R代表同位素比值；稳定碳同位素的世界标准为南卡罗莱纳州白垩第皮狄组的美洲拟箭石(PDB)。
稳定同位素主要用于同位素示踪和作为温度计。Benson et al.[56]综述了稳定同位素作为重要的示踪手段已被广泛应用于多个学科领域，主要包括地质学、地球化学、植物生理学、农业、林业、生态学、环境科学、医学和药理学等[57,58]。近年来，稳定同位素还被应用于营养学及食品和药品的品质监制[59]。
2.1.2稳定碳同位素示踪蜂蜜掺杂的原理
2.1.2.1植物的光合作用途径
光合作用(Photosynthesis)是指绿色植物利用光能，同化二氧化碳和水，制造有机物质并释放氧气的过程。
光合作用可分为光反应和暗反应两个阶段。在光反应阶段，发生水的光解、O2的释放及ATP和NADPH (还原辅酶II)的生成。反应发生于叶绿体的类囊体膜中，该阶段需要光的参与。在暗反应阶段，利用光反应形成的ATP和NADPH来同化(或称固定)CO2，并还原为糖。反应发生于叶绿体基质中，该阶段无需光的参与。
CO2的同化途径有三条，即卡尔文循环、C4途径和景天酸代谢(CAM)途径。其中卡尔文循环是最基本的CO2同化途径，该途径既可固定CO2，也可还原CO2。该途径存在于所有植物中。只有卡尔文循环具有合成淀粉等产物的能力，而C4途径和CAM谢途径仅为附加途径，其作用是固定CO2，并把所固定的CO2转运给卡尔文循环。C4途径和CAM途径分别存在于C4植物和CAM植物中。
卡尔文循环(Calvin cycle)[40]：20世纪50年代，美国的Calvin及其同事用14C标记和纸层析技术研究植物的光合作用时发现，植物固定CO2的原初产物为3-磷酸甘油酸(PGA)。CO2受体为一种戊糖(核酮糖二磷酸，RuBP)，而RuBP是从CO2固定后的产物PGA中转化而来，从而确定了CO2的同化过程是个循环反应。由于PGA是三碳化合物，故也称C3途径(图2–1)。
卡尔文循环具有合成淀粉等有机物的能力，是所有植物光合作用的基本途径，它大致可分为三个阶段，即羧化阶段、还原阶段和再生阶段。卡尔文循环的总反应式为：
3CO2 + 3H2O + 3RuBP + 9ATP + 6NADPH ? PGAL+ 6NADP + 9ADP + 9Pi (2–2)