与氮素同化相关酶及测定方法

工作曲线 即可查得丙酮酸体积 (ml),若查得的丙酮酸体积超过 0.2ml时应将酶粗制液稀释 后再进行测定 , 测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积 V(ml) 。工作曲线绘制 : 取 10ml 试管 6 支 , 各管加 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0.1ml, 分别加 GPT 底物液 0.5 、 0.45 、 0.40 、 0.35 、 0.30 、 0.25ml, 丙酮酸标准液 0( 对照管 ) 、 0.05 、 0.10 、 0.15 、 0.20 、 0.25ml。置37℃水浴中 5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀, 再置37℃水浴 中 20min, 取出后各管加 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 5ml, 混匀 ,10min 后同上比色 , 读取各 管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度 ,以各管丙酮酸体积为横座标 ,以相 应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。 (四)结果计算 转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(μmol)表示。 GOT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2) GPT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2) 式中 ,C— 丙酮酸标准溶液的浓度 (μmol/ml);V— 由工作曲线查得的丙酮酸体积 (ml);20— 稀释倍数 ;2— 反应时间换算系数 ,GOT 实际反应时间为 1h, 按习惯本法酶 活性以30min计算〔4〕,故应除以2;m—植物鲜重(g)
NO2-
NiR，Fe、Mn
根、叶绿体
NH3
NR：硝酸还原酶(nitrate reductase) NiR：亚硝酸还原酶(nitrite reductase)
氨的同化
植物吸收铵盐以后，或当植物所吸收的硝酸盐被 还原成氨后，氨必须立即被同化成氨基酸，否则就会 毒害植物。因为氨可能抑制呼吸过程中的电子传递系 统。 氨的同化方式为：进入谷氨酸合成酶循环。
COOH CH2 + CH2 H-C-NH2 COOH
3. 酰胺(amide)的形成及意义
形成：NH3＋
谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶 谷氨酰胺(Gln)
天门冬氨酸(Asp) ATP
天门冬酰胺(Asn)
意义：①贮存氨基；
②解除氨毒；
③参与代谢。
（二）植物对有机氮的吸收与同化
1. 尿素 urea（酰胺态氮 amide nitrogen）
(1) 吸收：根、叶均能直接吸收
(2) 同化：
脲酶 水解
①脲酶途径：尿素
NH3
瓜氨酸
氨基酸
②非脲酶途径：直接同化 尿素 氨甲酰磷酸 精氨酸
尿素的毒害：当介质中尿素浓度过高时，植物 会出现受害症状
2. 氨基态氮(amino nitrogen)
可直接吸收，效果因种类而异
第一类 效果 > 硫酸铵：如甘氨酸、天门冬酰胺等
与氮素同化相关酶及测定方法
自 然 界 中 N 素 循 环
一、植物体内氮的含量与分布
含量：占植物干重的0.3～5％。
植物种类：豆科植物>非豆科植物 品种：高产品种>低产品种 器官：种子>叶>根>茎秆
二、氮的生理功能
1. 氮是蛋白质的重要成分（蛋白质含氮16～18％）
2. 氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮约占植 株全氮的7％） 3. 氮是酶的成分
②谷草转氨基作用
谷丙转氨酶 CH 3 （ GPT） 磷酸吡 哆醛
COOH CH2 + CH C=O 2 H-C-NH2 COOH COOH
COOH COOH CH2 CH2 H-C-NH2 + CH2 C=O COOH COOH
谷草转氨酶 COOH （ GOT） CH 2 磷酸吡 C=O 哆醛 COOH
1· 酶粗制剂的提取 将 新 鲜 植 物 材 料 剪 碎 , 取 鲜 重 0.2g 左 右 放 入 研 钵 , 加 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液 (pH7.2)2.0ml, 在冰浴中研磨 , 得到 的匀浆用高速离心机 20000×g离心20min,上清液供测酶活 度用。 2· 谷草转氨酶(GOT)活度测定 取 10ml 试管 2 支 , 一支作测定管 , 分别加酶粗制剂 0.1ml 和 GOT底物液0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将 二管同时置 37℃水浴 ,60min 后取出 , 各管加 2,4 二硝基苯肼 液0.5ml终止反应,对照管再加GOT底物液0.5ml。将二管再 置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混 匀 ,10min 后用分光光度计比色 , 波长 500nm, 蒸馏水调零点 , 读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度 , 得吸光 度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。若查得的丙 酮酸体积超过 0.2ml 时应将酶粗制液稀释后再进行测定 ,测 定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。
氮素通常被称为生命元素
三、植物对氮的吸收(adsorption)与同化
(assimilation)
植物从外界环境获得N主要是通过 3条途径, 通过NO3- 还原把无
机氮转化为生命体可用的有机氮, 通过固氮菌对 N2的固定, 直接吸
收土壤中的铵或有机氮。
植物的氮源主要是铵盐和硝酸盐，占土壤含氮的1%-2%。
(5)1mol/L氢氧化钠溶液:40g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 (6)丙酮酸标准液(2μmol/ml):精确称取纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容 量瓶中,加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。 (7)GOT底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L): 称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入 1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml 容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 (8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L): 称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小烧杯中,加入 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氢氧 化钠调pH至7.4(约加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml混匀, 加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。
2谷氨酸
谷氨酸＋17酮酸
17种氨基酸
合成
蛋白质
转氨基作用（transamination）
（1）定义：是指一种α -氨基酸和α -酮酸在转氨酶的作 用下生成相应的α-酮酸和新的氨基酸的过程。
谷丙转氨基作用 （2）生物体内两种重要的转氨基作用 谷草转氨基作用
①谷丙转氨基作用
COOH CH3 CH2 H C NH2 + CH2 C=O COOH COOH
无机态： NO3-－N、NH4+－N （主要） 吸收的形态 有机态：NH2 －N、氨基酸、 核酸等 （少量）
（一）植物对硝态氮的吸收与同化
1. 吸收：旱地作物吸收NO3-－N为主，主动吸收
2. 同化
(1) NO3-－N的还原作用(nitrate reduction)
过程：
NO3-
NR，Mo
根、叶细胞质
4.氮是叶绿素（叶绿素a:C55H72O5N4Mg)的成分 （叶绿体含蛋白质45～60％）
5. 氮是多种维生素的成分:如维生素B1 (C12H17ON3S)、B2 (C17H18O6N4 )、B6(C6H11O3N)
6. 氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK） 7. 氮也是生物碱的组分（如烟碱、茶碱、可可 碱、咖啡碱、胆碱－－卵磷脂(磷脂酰胆碱）
第二类，尿素 < AA效果 < 硫酸铵：如天门冬氨酸等
第三类，效果 < 尿素：如脯氨酸、缬氨酸等
第四类，有抑制作用：如蛋氨酸
植物转氨酶(GOT和GPT)活度比色测定方法及其应及GOGAT酶活 性的测定 主要试剂 (1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2):0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷 (24.2g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml和 0.2mol/L HCl44.2ml,用蒸馏水稀释至200ml。 (2)0.1mol/L磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠 (AR)11.928g,磷酸二氢钾 (AR)2.176g,加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。 (3)2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml,保存于棕色瓶中备用,此液可保存 3个月。 (4)0.4mol/L氢氧化钠溶液:16g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。
作用酶类：
GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于叶绿体。 GS:谷氨酰胺合成酶；存在于叶绿体和细胞质中。 GDH:谷氨酸脱氢酶；存在于线粒体中。
过程（1）GDH（谷氨酸脱氢酶）途径
氨
酮酸
酮戊二酸
谷氨酸脱氢酶
谷氨酸
转氨基作用
氨
酰胺
各 种 新 的 氨 基 酸
• （2）GS-GOGAT途径
• （谷氨酰胺合成酶－谷氨酸合成酶）
• 是高等植物同化氨的主要途径
NADH
COOH │ CHNH2 │ CH2 │ CH2 │ CONH2
铁氧还蛋白 C来自百度文库OH
│ C=O │ CH2 │ CH2 │ COOH
2H+，2e—
NH3
NADH
谷氨酰胺 合成酶
谷 氨 酰 胺
谷氨酸合成酶
谷氨酸 脱氢酶 COOH │ CHNH2 │ CH2 │ CH2 转氨基 │ 含氮化 COOH
提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl2· 6H2O，203.3 ；β-琉基乙醇原液14.4mol/L） 1L提取液的配置：12.114g Tris+0.3722g EDTA+0.2033g MgCl2· 6H2O 用900ml水溶解，+0.7mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/L HCl调pH值 至7.6，然后定容至1L。 500ml提取液的配置：6.057g Tris+0.1861g EDTA+0.1016g MgCl2· 6H2O用450ml水溶解，+0.35ml β-琉基乙醇原液后，用 1mmol/L HCl（原液稀释12000倍,83ul定容至100ml）调pH值至7.6 ，然后定容至500ml。
粗酶液制备 取1g水稻根/叶，置于冰浴的研钵中，加入少量石 英砂和3ml提取缓冲液（100mmol/L TrisHCl(pH7.6)含1.0mmol/L EDTA， 1.0mmol/LMgCl2· 6H2O，10mmol/L β-琉基乙醇）于 4℃研磨成匀浆。混合均匀后于高速冷冻离心机4℃ 、20,000g离心20min（13，000g 30min），收集上 清，即为粗酶提取液，置于-80℃冰箱中冻存，待 测。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力测定 。
ATP
NH3 NH4+吸收 NO3—还原 N2固定 光呼吸
COOH │ CHNH 2 │ CH2 │ CH2 │ COOH 谷氨酸
合物 作用 谷氨酸
图1 氨的同化途径的模式
反应式：
NH3＋谷氨酸＋ATP
谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺＋ADP＋Pi
谷氨酸合成酶
谷氨酰胺＋α -酮戊二酸＋2e－＋2H＋ 转氨酶
工作曲线绘制: 取10ml试管5支,各管加0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.1ml,分别加GOT底 物液 0.5 、 0.45 、 0.40 、 0.35 、 0.30ml, 丙酮酸标准液 0( 对照管 ) 、 0.05 、0.10、0.15、0.20ml。置37℃水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液 0.5ml,混匀,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氢氧化钠溶 液5ml,混匀,10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减 去对照管吸光度 ,以各管丙酮酸体积为横座标 ,以相应的吸光度差值 为纵座标绘制工作曲线。 3· 谷丙转氨酶(GPT)活度测定 取10ml试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0.1ml和GPT底物液 0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将二管同时置37℃水浴 ,30min 后取出 , 各管加 2,4- 二硝基苯肼液 0.5ml 终止反应 , 对照管再加 GPT 底 物 液 0.5ml 。 将 二 管 再 置 37℃ 水 浴 中 20min, 取 出 后 各 管 加 0.4mol/L NaOH 5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸 馏水调零点 ,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度 , 得吸 光度差值,查