小RNA转染,慢病毒转染

三、RNAi转染真核细胞

1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）

（1）将覆盖率为30-50%（低密度转染细胞可以使转染和分析之间的间隙更长）的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。

（2）取质粒100pmol稀释到250μl的only体系中，同样取lipo2000试剂5μl稀释到250μl的only体系中，室温静置lipo2000稀释液5min（注意避免不要使lipo2000直接接触塑料且静止时间不要超过5min）。

（3）5min后将质粒稀释液加入到lipo2000稀释液中，颠倒混匀后室温静置20min （注意不要超过20min）。

（4）将孵育好的混合物缓慢匀速加入6孔板中，且最好边加边晃动板子，避免lipo2000局部毒性对细胞造成损伤。

（5）加完后放入37℃培养箱内培养，转染6h后更换新鲜培养液。

（6）24h显微镜下观察细胞状态及时处理（如荧光强弱、传入10cmdish内等），如需药筛48h后即可加药，筛选稳定克隆。

2、Fugene（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）

（1）取覆盖率为80-90%细胞更换新鲜培养液。

（2）将3 μg的DNA稀释到150 μl的only中

（2）取fugene 9μl加入到上述DNA稀释体系中，室温孵育12min。

（3）将孵育好的混合物缓慢加入6孔板内，边加边晃动。

（4）24h后观察细胞状态换液，48h后可以进行药筛筛选克隆。

四、慢病毒转染

1、实验前的准备

（1）质粒的准备：

目的质粒；包装质粒1.0和包装质粒2.0

提质粒时注意用去内毒素的试剂盒提取质粒，根据自己的用量提取质粒，并测浓度。

（2）293T细胞的准备

293T细胞是一种易于转染的工具细胞，可作为病毒包装的细胞，在10cm的dish中铺好293T 细胞，并待铺到80%时，就可以转染了。

（3）转染试剂的准备

转染293T时，用普通的转染试剂（本组用lipo2000和Fugene），本组的转染试剂转染10cm的dish时约需50μl，因此实验前应确认转染试剂是否充足。（根据转染细胞的多少，确定转染试剂的用量，具体见转染试剂说明书）

（4）宿主细胞的准备

293T细胞转染后约48h后可收集好病毒，因此在病毒收集前24h应将目的

细胞铺到六孔板中，等病毒收集好以后即可感染。一般从一个10cm的dish中收集到的病毒可以感染2-3个孔（六孔板）

（5）安全注意事项

慢病毒具有一次感染效力，因此操作时应注意防止慢病毒污染，穿白大衣，戴好手套和口罩，接触过病毒的器具用1%的SDS或巴斯消毒水浸泡过夜扔掉。

在安全柜中操作，不能在一般的超净台中操作，操作完的工作台用75%酒精擦拭。显微镜下观察感染的细胞后，用75%酒精喷撒到载物台上消毒。

离心时，应将离心管管口用封口膜封好后再离心。

2、实验步骤

（1）病毒的包装：共转染293T细胞

项目用量

转染试剂（Fugene/Lipo2000）50μl

目的质粒16μg（20）

包装质粒1.0 8μg（10）

包装质粒2.0 8μg（10）

DMEM 高糖only 补足800μl

总体系800μl

转染的具体步骤根据转染试剂的说明书进行，以下转染试剂及转染质粒的用量是根据本组常规实验拟（转染一个10cm dish的293T），转染时，注意293T 细胞贴壁不牢，转染试剂混合液应从dish的边缘轻轻滴加，并不断的轻轻摇匀。（2）收集病毒液

a)转染后48h收集病毒液，将培养293T的细胞培养液吸到15ml离心管中，

用封口膜封好后，2000r/min离心5min以去除培养液中的细胞

b)将上清吸出（注意不要吸到管底的细胞）到50ml的浓缩管中，用封口膜

封好后，2500r/min离心约10min，取出观察浓缩管中剩余的病毒液的量，

然后根据病毒液的多少选择离心时间，注意不能将液体离心完，约剩

300-500μl时停止离心

c)用黄枪头吸出病毒液于1.5ml的EP管中，封口膜封好，一般刚收集好的

病毒即可感染目的细胞，若不能马上感染细胞，应保存到-80℃备用（3）感染目的细胞（六孔板）

a)计划每孔感染用的病毒量，根据经验，一个10cm的dish所收集到的病

毒约可感染2-3个孔的细胞

b)给目的细胞直接换液后，加入病毒液和助转剂；或者将目的细胞培养液

换成病毒液、培养液和助转剂混合液

c)72h后加药筛选，若细胞死亡较多，可以隔几个小时给细胞换液，以免

死亡细胞产生有害物质杀死耐药细胞

d)如果转入的质粒带有荧光，可以在荧光显微镜下观察荧光，转染效率

e)待未转染孔的细胞全部死亡，即可挑取细胞克隆（病毒感染可不挑克隆，

但要使感染细胞稳定，挑出克隆较好）