第一章1 显微镜技术
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1752 英国望远镜商人J. Dollond 发明消色差 显微镜。
1812 苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜，并 改进了体视显微镜。
Robert Hooke和他的显微镜
6.1886 德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并 改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成 熟。
数值孔径与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦 深成反比，N.A.值增大，视场宽度与工作距离都会 相应变小。
介质 折射率
空气 1
水
香柏油 α溴萘
1.33 1.515
1.66
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～1.78，所 用介质的折射率越接近玻璃的越好。
干燥系物镜N.A.<1,介质为空气，一般为0.05-0.95。
（3）放大率（magnification）
在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小 比例。
决定于物镜、镜筒长度和目镜。 分辨率与放大率：在物镜分辨率的一定条件下，
加大目镜放大倍数可能招致物像模糊，降低显微 镜的性能。
（4）焦深（focal depth）
焦深为焦点深度的简称。在使用显微镜时，当焦点 对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可 以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能 看得清楚，这个部分就是焦点深度。
根据显微镜的构造可以分为倒置显微镜、 实体显微镜和比较显微镜等。
激光扫描显微镜。
1.1.3 显微镜的成像 原理
倒
1.1.4 影响成像的关键因素—像差
透镜本身存在着一系列缺陷，影响显微镜成 像的质量，这些缺陷名为像差。包括：
由于不同波长的光线折射率不同造成的色差以 及场曲等。
焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比；焦深 大，分辨率降低。
（5）视场直径（field of view）
也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到 的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。
计算方法：FV= FN /Mob，FV：视场直径；FN： 视场数（Field Number，是目镜的固定参数，标 刻在目镜的外面）；Mob：物镜放大率
视场直径与视场数成正比；增大物镜的倍数，则 视场直径减小。
（6）覆盖差
由于盖玻片厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产 生折射后的光路发生了改变，从而产生的像差，称 为覆盖差。
国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17毫米，允许 范围在0.16-0.18毫米。物镜外壳上标刻的0.17，即 表明该物镜要求的盖玻片厚度。
(2) 球差（spherical aberration）
球差是轴上点的单色像差，是由于透镜的球形表面 造成的。球差造成的结果是，一点成像后，不是一 个亮点而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑。
球差的矫正常利用不同材料的凸凹透镜组合来消除。
（3）慧差（coma）
慧差属轴外点的 单色像差。轴外 物点以大孔径光 束成像时，发出 的光束通过透镜 后，不再相交一 点，则一光点的 像便会得到一逗 点状，形如彗星， 故称“慧差”。
英国物理学家胡克（R.Hooke,1663-1703）制造 了第一台具有科学价值的显微镜，他首次观察 到木栓的显微图象，发现了细胞。
真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克 （Antonie Van Leeuwenhoek,1632-1723），他 用自制的显微镜观察到了池塘中的原生动物、 细菌等。
第一章 显微镜技术
Technology of Microscope
生物显微技术是指在显微镜下对生命有机体的 微观世界进行定性观察（辨别颜色、形状、质 地）、定量描述（测量、计数、绘图）以及细 微结构的解剖等技术的总称。
1.1 显微镜基础知识
1.1.1显微镜的历史
最早的显微镜是荷兰的眼镜商詹森 （Z.Jansen,1588-1628）于1604年制造的。
（3）聚光器（condenser）
聚光器是由聚光镜、孔径光阑、滤光镜等组成。 将反光镜反射来的光线集中以射入接物镜和接目 镜，不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源 射来的光的性质。
小型的显微镜无聚光镜，在使用数值孔径0.40以 上的物镜时，则必须具有聚光镜。
聚光镜的结构有多种，根据物镜数值孔径的大小， 相应地聚光镜的要求也不用。
场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个 光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点 都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。 当调焦至画面中央处的影像清晰时，画面四周的影 像模糊；而当调焦至画面四周处的影像清晰时，画 面中央处的影像又开始模糊。
（6）畸变 （distortion）
由于透镜边缘和中央部分的折射不同造成的球 差。
用组合透镜可以纠正一定程度的像差。
(1) 色差（chromatic aberration）
色差现象是不同波长和颜色的光线通过透镜的折射角度不 同而引起的。白光由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫组成， 各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同， 这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。 位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环，使像 模糊不清。 而放大色差使像带有彩色边缘。
油浸系物镜一般N.A.>1,最大为1.4
（2）分辨率（resolving power）
显微镜的分辨率是指显微镜的最小分辨距离，即 显微镜将物体放大成像后，能将物体相近两点分辨清 楚的极限距离。
分辨率的大小决定于光的波长和镜口率以及介质 的折射率，用公式表示为：
R=0.61λ /N．A． 入为光波波长， N.A. 为物镜镜口率ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ R越小，显微镜的分辨率就越高。
（7）工作距离（working distance）
工作距离：也叫物距，指物镜前透镜的表面到被 检物体之间的距离。
一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离 越小。
1.1.6 显微镜的构造
光学系统：物镜、目镜、聚光器等组成； 照明系统：提供光源； 机械系统：用于固定材料和观察方便。
校正物镜余留下来的像差； 将物像投射到一定的位置上，便于显微放映或
照相。
目镜的放大倍数M：M=250mm（明视距离） /fmm（目镜焦距），其中明视距离指从眼睛晶状 体到目镜所放大的虚象之间的距离，一般为 250mm。
显微镜的分辨率和镜像亮度有关系，而镜像亮度 又与目镜放大倍数相关，即目镜放大倍数越高， 镜像亮度越低。
阿贝聚光镜(Abbe condenser)：由两片透镜组成， 聚光能力较好，多用于普通显微镜，在物镜数值孔 径高于0.60显色差、球差。
消色差聚光镜(Achromatic aplanatic condenser)：对色差球差的校正程度很高，是质 量最高的一种聚光镜。不适用于4X以下的低倍镜。
（4）像散（Astigmatism）
像散也属于轴外点单色像差。当视场很大时，边 缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则 引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个 分离并且互相垂直的短线，形成一个椭圆形斑点。
通过复杂的透镜组合消除。
（5）场曲（curvature of field）
放大200倍，可采用：
10x的目镜与20x的物镜配合
20x的目镜和10x的物镜配合
何种组合分辨率更高？
（2）物镜（objective）
物镜的作用：
放大微小的物体或微细的结构，形成倒立实像； 把像投射到目镜光阑处。
物镜的放大倍数（W）：
W=160mm（光学筒长）/fmm（物镜焦距），光学 筒长是指物镜上、下焦点平面之间的距离，一般的 为160mm，也有170mm
物镜的分类
A、按物镜前透镜与盖玻片间的介质 （1）干燥系物镜 （2）水浸系物镜 （3）油浸系物镜 B、按物镜放大率的高低 （1）极低倍物镜：放大率< 1× （2）低倍物镜：放大率在1×—6× （3）中倍物镜：放大率在6×—25× （4）高倍物镜：放大率在25×—100×
C、按物镜校正像差的程度
摇出式聚光镜(Swing out condenser)：使用低倍 物镜时，由于视场大，造成视场边缘部分黑，中 央亮的情况，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇 出。
其他聚光镜：暗视野聚光镜、相差聚光镜、偏光 聚光镜、微分干涉聚光镜等，分别适用于相应的 观察方式。
（4）反光镜
显微镜观察时获得光源的装置，位于显微镜镜座 中央，一面为平面镜，一面为凹面镜。转动反光 镜，可使外面光线通过集光器照射到标本上。使 用时，光线强用平面镜，光线弱用凹面镜。
（1）消色差物镜（Achromatic objective，Ach）： 校正轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差 以及消除近轴点慧差
（2）复消色差物镜（Apochromatic objective， APO）：校正红绿蓝色差，红蓝光球差。
（3）半复消色差物镜（Semi Apochromatic objective，FL）氟石物镜，成像质量接近APO。
9.1981瑞士人G. Binnig和H. RoherI在苏黎世实验 中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道 显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺 贝尔物理学奖。
1.1.2 显微镜的分类
可见光显微镜利用光谱的可见光部分（390-
760nm）成像的显微镜。
（4）平场物镜（Plan objective）增加一块半月形厚 透镜，校正场曲，适用于镜检和显微照相。
Cover glass
D、特种物镜
（1）带校正环物镜（correction collar objective）： 校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。
（2）带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective）： 在物镜筒内装有虹彩光阑，调节光阑的大小，可改变 背景明暗。
被摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后 变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。
畸变像差只影响影像的几何形状，而不影响影像 的清晰度。这是畸变与球差、慧差、像散、场曲 之间的根本区别。
1.1.5 显微镜的重要光学技术参数
数值孔径 分辨率 放大率 焦深 视场直径 覆盖差 工作距离
不可见光显微镜可以分为紫外光显微镜（390nm
以下的紫外光）、红外光显微 镜（760nm以上的红外光）和X射线显微镜等。
可见光显微镜分为：
根据显微镜的照明技术分为明视野显微镜、 暗视野显微镜和荧光显微镜等
根据显微镜的成像技术分为相差显微镜、 干涉显微镜、微分干涉反差显微镜和偏光 显微镜等。
（1）数值孔径 (numeral aperture)
N．A．＝ｎsinα/2
又称镜口率，是指物镜框口能够纳进的光通量的大 小。是物镜和聚光镜的主要技术参数。常用N.A.或 A表示。数值孔径越大吸光量越多，分辨力越高。
n是指物镜与标本之间介质的折射率；α指镜口角， 也就是标本对物镜镜口的张角，为固定值。
7.1932 德国人M. Knoll和E. A. F. Ruska描述了一 台最初的电子显微镜，1940年美国和德国制造出 分辨力为0.2nm的商品电镜。
8.1932 荷兰籍德国人F. Zernike成功设计了相差显 微镜（phasecontrast microscope) ，并因此获 1953年诺贝尔物理奖。
（3）相差物镜（Phase contrast objective)：在物镜的 后焦平面处装有相板。
（4）长工作距离物镜（Long working distance objective)：倒置显微镜专用物镜，镜检组织培养、 悬浮液材料。
（5）无罩物镜（No cover objective)：用于不能加 盖玻片的样品，这种物镜外刻有NC，在盖玻片厚 度的位置标刻“0”。
（一）、显微镜的光学系统
（1）目镜（ocular）
目镜的组成：
一般由两块或两块以上的凸透镜组合而成。上面 与眼接触的叫接目透镜，下面的叫视野透镜。两 者之间或视野透镜下面有一个金属圆环叫光阑。 在光阑上可以安装目镜测微尺，有时可将毛发粘 在光阑上做成指针。
目镜的作用：
目镜把物镜所形成的倒立实像再放大成为一个 虚像；
1812 苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜，并 改进了体视显微镜。
Robert Hooke和他的显微镜
6.1886 德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并 改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成 熟。
数值孔径与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦 深成反比，N.A.值增大，视场宽度与工作距离都会 相应变小。
介质 折射率
空气 1
水
香柏油 α溴萘
1.33 1.515
1.66
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～1.78，所 用介质的折射率越接近玻璃的越好。
干燥系物镜N.A.<1,介质为空气，一般为0.05-0.95。
（3）放大率（magnification）
在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小 比例。
决定于物镜、镜筒长度和目镜。 分辨率与放大率：在物镜分辨率的一定条件下，
加大目镜放大倍数可能招致物像模糊，降低显微 镜的性能。
（4）焦深（focal depth）
焦深为焦点深度的简称。在使用显微镜时，当焦点 对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可 以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能 看得清楚，这个部分就是焦点深度。
根据显微镜的构造可以分为倒置显微镜、 实体显微镜和比较显微镜等。
激光扫描显微镜。
1.1.3 显微镜的成像 原理
倒
1.1.4 影响成像的关键因素—像差
透镜本身存在着一系列缺陷，影响显微镜成 像的质量，这些缺陷名为像差。包括：
由于不同波长的光线折射率不同造成的色差以 及场曲等。
焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比；焦深 大，分辨率降低。
（5）视场直径（field of view）
也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到 的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。
计算方法：FV= FN /Mob，FV：视场直径；FN： 视场数（Field Number，是目镜的固定参数，标 刻在目镜的外面）；Mob：物镜放大率
视场直径与视场数成正比；增大物镜的倍数，则 视场直径减小。
（6）覆盖差
由于盖玻片厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产 生折射后的光路发生了改变，从而产生的像差，称 为覆盖差。
国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17毫米，允许 范围在0.16-0.18毫米。物镜外壳上标刻的0.17，即 表明该物镜要求的盖玻片厚度。
(2) 球差（spherical aberration）
球差是轴上点的单色像差，是由于透镜的球形表面 造成的。球差造成的结果是，一点成像后，不是一 个亮点而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑。
球差的矫正常利用不同材料的凸凹透镜组合来消除。
（3）慧差（coma）
慧差属轴外点的 单色像差。轴外 物点以大孔径光 束成像时，发出 的光束通过透镜 后，不再相交一 点，则一光点的 像便会得到一逗 点状，形如彗星， 故称“慧差”。
英国物理学家胡克（R.Hooke,1663-1703）制造 了第一台具有科学价值的显微镜，他首次观察 到木栓的显微图象，发现了细胞。
真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克 （Antonie Van Leeuwenhoek,1632-1723），他 用自制的显微镜观察到了池塘中的原生动物、 细菌等。
第一章 显微镜技术
Technology of Microscope
生物显微技术是指在显微镜下对生命有机体的 微观世界进行定性观察（辨别颜色、形状、质 地）、定量描述（测量、计数、绘图）以及细 微结构的解剖等技术的总称。
1.1 显微镜基础知识
1.1.1显微镜的历史
最早的显微镜是荷兰的眼镜商詹森 （Z.Jansen,1588-1628）于1604年制造的。
（3）聚光器（condenser）
聚光器是由聚光镜、孔径光阑、滤光镜等组成。 将反光镜反射来的光线集中以射入接物镜和接目 镜，不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源 射来的光的性质。
小型的显微镜无聚光镜，在使用数值孔径0.40以 上的物镜时，则必须具有聚光镜。
聚光镜的结构有多种，根据物镜数值孔径的大小， 相应地聚光镜的要求也不用。
场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个 光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点 都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。 当调焦至画面中央处的影像清晰时，画面四周的影 像模糊；而当调焦至画面四周处的影像清晰时，画 面中央处的影像又开始模糊。
（6）畸变 （distortion）
由于透镜边缘和中央部分的折射不同造成的球 差。
用组合透镜可以纠正一定程度的像差。
(1) 色差（chromatic aberration）
色差现象是不同波长和颜色的光线通过透镜的折射角度不 同而引起的。白光由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫组成， 各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同， 这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。 位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环，使像 模糊不清。 而放大色差使像带有彩色边缘。
油浸系物镜一般N.A.>1,最大为1.4
（2）分辨率（resolving power）
显微镜的分辨率是指显微镜的最小分辨距离，即 显微镜将物体放大成像后，能将物体相近两点分辨清 楚的极限距离。
分辨率的大小决定于光的波长和镜口率以及介质 的折射率，用公式表示为：
R=0.61λ /N．A． 入为光波波长， N.A. 为物镜镜口率ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ R越小，显微镜的分辨率就越高。
（7）工作距离（working distance）
工作距离：也叫物距，指物镜前透镜的表面到被 检物体之间的距离。
一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离 越小。
1.1.6 显微镜的构造
光学系统：物镜、目镜、聚光器等组成； 照明系统：提供光源； 机械系统：用于固定材料和观察方便。
校正物镜余留下来的像差； 将物像投射到一定的位置上，便于显微放映或
照相。
目镜的放大倍数M：M=250mm（明视距离） /fmm（目镜焦距），其中明视距离指从眼睛晶状 体到目镜所放大的虚象之间的距离，一般为 250mm。
显微镜的分辨率和镜像亮度有关系，而镜像亮度 又与目镜放大倍数相关，即目镜放大倍数越高， 镜像亮度越低。
阿贝聚光镜(Abbe condenser)：由两片透镜组成， 聚光能力较好，多用于普通显微镜，在物镜数值孔 径高于0.60显色差、球差。
消色差聚光镜(Achromatic aplanatic condenser)：对色差球差的校正程度很高，是质 量最高的一种聚光镜。不适用于4X以下的低倍镜。
（4）像散（Astigmatism）
像散也属于轴外点单色像差。当视场很大时，边 缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则 引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个 分离并且互相垂直的短线，形成一个椭圆形斑点。
通过复杂的透镜组合消除。
（5）场曲（curvature of field）
放大200倍，可采用：
10x的目镜与20x的物镜配合
20x的目镜和10x的物镜配合
何种组合分辨率更高？
（2）物镜（objective）
物镜的作用：
放大微小的物体或微细的结构，形成倒立实像； 把像投射到目镜光阑处。
物镜的放大倍数（W）：
W=160mm（光学筒长）/fmm（物镜焦距），光学 筒长是指物镜上、下焦点平面之间的距离，一般的 为160mm，也有170mm
物镜的分类
A、按物镜前透镜与盖玻片间的介质 （1）干燥系物镜 （2）水浸系物镜 （3）油浸系物镜 B、按物镜放大率的高低 （1）极低倍物镜：放大率< 1× （2）低倍物镜：放大率在1×—6× （3）中倍物镜：放大率在6×—25× （4）高倍物镜：放大率在25×—100×
C、按物镜校正像差的程度
摇出式聚光镜(Swing out condenser)：使用低倍 物镜时，由于视场大，造成视场边缘部分黑，中 央亮的情况，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇 出。
其他聚光镜：暗视野聚光镜、相差聚光镜、偏光 聚光镜、微分干涉聚光镜等，分别适用于相应的 观察方式。
（4）反光镜
显微镜观察时获得光源的装置，位于显微镜镜座 中央，一面为平面镜，一面为凹面镜。转动反光 镜，可使外面光线通过集光器照射到标本上。使 用时，光线强用平面镜，光线弱用凹面镜。
（1）消色差物镜（Achromatic objective，Ach）： 校正轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差 以及消除近轴点慧差
（2）复消色差物镜（Apochromatic objective， APO）：校正红绿蓝色差，红蓝光球差。
（3）半复消色差物镜（Semi Apochromatic objective，FL）氟石物镜，成像质量接近APO。
9.1981瑞士人G. Binnig和H. RoherI在苏黎世实验 中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道 显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺 贝尔物理学奖。
1.1.2 显微镜的分类
可见光显微镜利用光谱的可见光部分（390-
760nm）成像的显微镜。
（4）平场物镜（Plan objective）增加一块半月形厚 透镜，校正场曲，适用于镜检和显微照相。
Cover glass
D、特种物镜
（1）带校正环物镜（correction collar objective）： 校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。
（2）带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective）： 在物镜筒内装有虹彩光阑，调节光阑的大小，可改变 背景明暗。
被摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后 变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。
畸变像差只影响影像的几何形状，而不影响影像 的清晰度。这是畸变与球差、慧差、像散、场曲 之间的根本区别。
1.1.5 显微镜的重要光学技术参数
数值孔径 分辨率 放大率 焦深 视场直径 覆盖差 工作距离
不可见光显微镜可以分为紫外光显微镜（390nm
以下的紫外光）、红外光显微 镜（760nm以上的红外光）和X射线显微镜等。
可见光显微镜分为：
根据显微镜的照明技术分为明视野显微镜、 暗视野显微镜和荧光显微镜等
根据显微镜的成像技术分为相差显微镜、 干涉显微镜、微分干涉反差显微镜和偏光 显微镜等。
（1）数值孔径 (numeral aperture)
N．A．＝ｎsinα/2
又称镜口率，是指物镜框口能够纳进的光通量的大 小。是物镜和聚光镜的主要技术参数。常用N.A.或 A表示。数值孔径越大吸光量越多，分辨力越高。
n是指物镜与标本之间介质的折射率；α指镜口角， 也就是标本对物镜镜口的张角，为固定值。
7.1932 德国人M. Knoll和E. A. F. Ruska描述了一 台最初的电子显微镜，1940年美国和德国制造出 分辨力为0.2nm的商品电镜。
8.1932 荷兰籍德国人F. Zernike成功设计了相差显 微镜（phasecontrast microscope) ，并因此获 1953年诺贝尔物理奖。
（3）相差物镜（Phase contrast objective)：在物镜的 后焦平面处装有相板。
（4）长工作距离物镜（Long working distance objective)：倒置显微镜专用物镜，镜检组织培养、 悬浮液材料。
（5）无罩物镜（No cover objective)：用于不能加 盖玻片的样品，这种物镜外刻有NC，在盖玻片厚 度的位置标刻“0”。
（一）、显微镜的光学系统
（1）目镜（ocular）
目镜的组成：
一般由两块或两块以上的凸透镜组合而成。上面 与眼接触的叫接目透镜，下面的叫视野透镜。两 者之间或视野透镜下面有一个金属圆环叫光阑。 在光阑上可以安装目镜测微尺，有时可将毛发粘 在光阑上做成指针。
目镜的作用：
目镜把物镜所形成的倒立实像再放大成为一个 虚像；