树突状细胞培养与鉴定

树突状细胞的培养与鉴定

【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原

cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用

gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式

molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting

peripheral blood mononuclear cells (pbmc) with dynal magnetic negative isolation kit. monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (il-4) and granulocyte-macrophage

colony-stimulating factors (gm-csf) for 7days. cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。allogenic lymphocyte proliferation assay was done by mixing dendritic cells with nave cord blood mononuclear cells and then coculture for 4 days. results：upon culture with gm-csf plus il-4, cd14+ cells rapidly became non-adherent clustered, developed into a morphologically homogeneous cell population with different extents of veiled morphology. analysis of surface markers showed that the cells became cd14－ and expressed high levels of hla-dr、cd80、cd86, and cd40. cells showed high capacity of stimulating nave lymphocytes to proliferate. conclusions: facs analysis and functional capacity identified the cells with typical veils as dendritic cells.

【key words】 dendritic cell, magnetic, flow cytometry 树突状细胞（dendritic cells， dcs）是免疫系统中强有力的免疫调控细胞(banchereau,1998)。随着树突状细胞在基因治疗及免疫治疗的应用，以及人们对免疫反应机制的不断探索研究，树突

状细胞的分离、纯化、培养与鉴定技术也得到了飞速的发展。目前国内实验室在如何在体外培养出高质量的dcs的技术依然很欠缺。本研究在国外一些研究的基础上，经过改进探索了一套较成熟、简单、高效的培养树突状细胞的方法，并通过细胞形态、表型、功能等方面鉴定细胞为树突状细胞，为今后这方面的实验研究提供一条可供选择的技术方法。

1 材料与方法

1.1 树突状细胞的培养取20ml左右的新鲜分离的白细胞悬液（武汉市中心血站），与pbs（ph=7.2）等体积混合，利用

ficoll-paque plus (amersham biosciences)密度梯度离心分离得到单个核细胞，约3×107/ml，利用dynal单核细胞磁珠分离试剂盒(dynal biotech)，得到高纯度单核细胞，重悬于加入20％

fcs(gibco）的rpmi-1640 (gibco）培养基中，调整密度至5×105/ml，接种六孔板中（bd corporation），加入rhgm-csf (r&d)终浓度50ng/ml， il-4（r&d）终浓度20ng/ml，隔天半量换液，37℃5％co2，培养至5天左右，加入tnf-α100ng/ml（peprotech），培养第7－8天收获悬浮细胞。

1.2 流式细胞术分析单核细胞和树突状细胞的表型收集磁珠

分选后的细胞悬液，调整细胞密度并分别加入20μl pe –mouse igg1k isotype control以及pe-anti human cd14抗体，4℃避光孵育45min，pbs洗涤两次，1％多聚甲醛固定，流式细胞仪分析。收集培养至7-8天左右细胞，分别加入pe标记的鼠抗人cd14，