培养基配制和灭菌方法验证
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
培养基验证
1. 稀释液的制作磷酸盐缓冲稀释液贮存液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g蒸馏水 500mL用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2（图1-1、1-2），用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。
1-1 1-22. 培养基制作①计算出所需数量，用电子称、称量纸、药勺来称取。
②放入比所用蒸馏水大的烧瓶中，使之充分混匀于蒸馏水后加热溶解并煮沸。
※备注：即使是同一培养基，各个厂家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分参照培养基上的说明。
2.1 倾注培养培养基：加温溶解（高压灭菌）保存使用时溶解倾注●平板计数琼脂等：高压灭菌后保存，使用时加温溶解。
●去氧胆酸盐琼脂培养基：使用时将培养基粉末加温溶解。
※备注：倾注培养时，向培养基分注的步骤参照下述的注意事项①样液稀释以及从接种到培养基混合完毕，最好在15分钟以内完成。
②每个平皿的分注量约15-20ml。
分注后将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从平皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。
③分注时三角烧瓶挂有培养基滴时，下一次分注的培养基可能被烧瓶外壁的细菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再将瓶口用火焰灭菌。
2.2 平板培养基：平板培养基是将溶解后的培养基分注15-20ml到无菌平皿里，使之凝固。
●TCBS琼脂培养基、DHL琼脂培养基：加温溶解后，分注、凝固、干燥表面。
为了防止沉淀的发生，加温溶解后要充分混匀（注意不要起泡）。
●EMB琼脂培养基：高压灭菌后，分注、凝固、干燥表面。
●卵黄甘露醇高盐琼脂培养基：将鸡蛋放在95%酒精中浸泡1小时左右，用酒精棉（纱布）擦拭蛋壳表面，打开鸡蛋取出卵黄。
加入经高压灭菌后冷却到55-60℃培养基里（6%卵黄）搅拌摇匀凝固后干燥表面（搅拌时不要起泡）。
若培养基温度过高，卵黄凝固，过低则培养基分注时开始结块，所以操作要迅速。
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告一、引言在微生物学研究中，培养基的制备与灭菌是非常重要的步骤。
培养基是供养微生物生长和繁殖所必需的营养物质的混合物，而灭菌则是为了消除其中的有害微生物，保证培养基的纯净度。
本实验旨在探讨培养基的制备与灭菌的方法与步骤，以及其对微生物培养的影响。
二、培养基的制备2.1 选择培养基成分培养基的成分根据所需培养的微生物种类和目的而定，常见的成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
在制备培养基之前，需要明确所需微生物的营养需求，选择合适的成分。
2.2 配制培养基根据所选的成分和配方，按照一定比例将各种成分溶解在适当的溶剂中，常见的溶剂包括蒸馏水和生理盐水。
注意溶解顺序和温度，保证各种成分充分溶解。
2.3 调节pH值微生物对pH值的要求各不相同，因此在制备培养基时需要调节pH值。
使用酸碱溶液逐滴加入培养基中，同时使用pH试纸或pH计检测pH值，直到达到所需的范围。
2.4 灭菌前的处理在灭菌之前，需要对培养基进行一些处理，包括过滤、加热和冷却等。
过滤可以去除其中的固体杂质和大颗粒微生物。
加热可以杀灭其中的有害微生物，常用的方法包括高温灭菌和压力灭菌。
冷却后的培养基可以用于微生物的培养。
三、灭菌实验3.1 高温灭菌高温灭菌是常用的灭菌方法之一，其原理是利用高温杀灭微生物。
将配制好的培养基倒入培养瓶中，盖上瓶盖，放入高温灭菌器中。
设置合适的温度和时间，一般为121℃，15-20分钟。
高温灭菌后的培养基可以用于无菌条件下的微生物培养。
3.2 压力灭菌压力灭菌是一种利用高温和高压杀灭微生物的方法。
将配制好的培养基倒入培养瓶中，盖上瓶盖，放入压力灭菌器中。
设置合适的温度和压力，一般为121℃，15-20分钟。
压力灭菌后的培养基可以用于无菌条件下的微生物培养。
3.3 灭菌效果验证灭菌后的培养基需要进行灭菌效果验证，以确保其中没有活菌存在。
常用的方法包括接种试验和平板计数法。
接种试验是将灭菌后的培养基接种到无菌平板上，观察是否有菌落生长。
药典无菌检查方法验证及操作要点
2. 培养基
2.1 培养基的灭菌 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.2 培养基的保存 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的
环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三 周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内 使用。
•
2.3 培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养
。改良马丁培养基置23～28℃培养。 2.4 培养基的适用性检查
•
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，
加入3～5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗
脱
吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌
棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌
试管内
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢
子数小于l00cfu的孢子悬液。 •
4.3 薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲
药典无菌检查方法验证 及操作要点
2020年4月29日星期三
1 前言 1.1 定义
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药
品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方
法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明
了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
•
1.2 实验环境条件要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的 局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方 法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔 离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。
3）枯草芽孢杆菌
(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]
hanks配制与灭菌实验报告
hanks配制与灭菌实验报告Hanks配制与灭菌实验报告摘要：本实验旨在通过配制Hanks液体培养基以及进行灭菌实验，验证Hanks液体培养基的配制方法的准确性和灭菌方法的有效性。
实验结果表明，配制的Hanks液体培养基符合要求，能够支持细胞生长和繁殖；而经过灭菌处理后的培养基能够杀灭细菌和其他微生物的生长，确保实验的无菌性。
1. 引言Hanks液体培养基是一种常用的细胞培养基，广泛用于细胞培养、细胞实验和细胞学研究中。
为了保证培养基的品质和无菌性，正确的配制方法和灭菌处理是非常重要的。
2. Hanks液体培养基的配制方法Hanks液体培养基的配制方法如下：1) 准备所需材料：Hanks盐、葡萄糖、无菌水。
2) 称取适量Hanks盐，并加入适量无菌水中溶解。
3) 加入适量葡萄糖，继续搅拌溶解。
4) 调整溶液的pH值至7.4左右。
5) 加入适量的无菌水，使溶液体积达到所需的总体积。
6) 过滤并分装至无菌培养瓶中。
3. Hanks液体培养基的质量控制为了确保配制的Hanks液体培养基的质量，我们需要进行质量控制。
主要包括以下几个方面：1) pH值的测定：使用pH计测定Hanks液体培养基的pH值，确保其在7.2-7.6之间。
2) 游离氨基酸测定：通过游离氨基酸测定方法，检测Hanks液体培养基中游离氨基酸的浓度，确保其符合要求。
3) 空白对照培养：将配制好的Hanks液体培养基分装至无菌培养瓶中，进行空白对照培养，观察是否有微生物生长。
4. Hanks液体培养基的灭菌方法为了确保Hanks液体培养基的无菌性，我们需要进行灭菌处理。
常用的灭菌方法有以下几种：1) 高温灭菌：将Hanks液体培养基装入无菌容器中，放入高压灭菌锅中进行高温高压灭菌处理。
2) 过滤灭菌：使用无菌滤器将Hanks液体培养基过滤，去除其中的微生物。
3) 紫外线灭菌：将Hanks液体培养基装入无菌培养瓶中，置于紫外线灭菌器中进行紫外线照射。
培养基配制和灭菌方法验证
4.2.3.硫乙醇酸盐流体培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
菌株代数
培养基
培养温度
培养时间（小时）
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
4.2.验证容
4.2.1.执行标准
a.配制容器及配套器具的清洗格按照《玻璃器皿清洗操作规程》执行。
b.培养基的配制格按照《培养基管理规程》执行。
c.自动台式灭菌器格按照《TMQ.R-3870型台式灭菌器使用维护保养操作规程》执行.
a.无菌性检查
每批培养基随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
b.灵敏度检查
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu（菌落形成单位） 的菌悬液。
《中华人民国药典》2010年版二部规定：在实验室中，若采用已验证的配置和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。
本公司采用的培养基均是北京三药科技开发公司生产的市售脱水培养基。为规生测实验人员在配制培养基时标准化、程序化并符合《中华人民国药典》2010年版二部规定，特对培养基的配制程序进行验证。
c.分装 将已调节好PH值的硫乙醇酸盐流体培养基分装至25×250ml试管中，分装的管数为190～200管围，用牛皮纸按40管/捆的式包扎结实。其中一管只装约20ml，以备灭菌后最终pH值测定。
培养基无菌性试验
7.4.1 培养基配制及器具的灭菌操作人：复核人：日期：7.4.1.2 除菌过滤前TSB培养基微生物限度检验检查依据：微生物检查参照《微生物限度测定标准操作规程》（QC117）,采用薄膜过滤法.营养琼脂培养基的配制：称取营养琼脂培养基干粉（中检所监制，批号：）g，加纯化水ml加热溶解。
检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。
灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：玫瑰红钠琼脂培养基的配制：称取玫瑰红钠琼脂培养基干粉（中检所生产，批号：）g，加纯化水ml，加热溶解。
检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。
灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：Rodac碟培养基的的配制：称取胰酪胨大豆肉汤培养基干粉（上海中科，批号：）g ，卵磷脂（国药集团，批号：）g，吐温80（批号：）g，加入纯化水ml,微温使其溶解，用1.0M的氢氧化钠调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，加入琼脂g，加热使其溶解。
灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。
Rodac碟的批号：，生产厂商：，数量：。
操作人：复核人：日期：取样用试管的准备：准备10 ml试管支，内装2 ml生理盐水和一根医用棉签，管口用医用纱布包裹的脱脂棉塞塞住，再用牛皮纸封口。
灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：检查人：复核人：检查日期：报告日期：7.4.1.4 除菌过滤器的膜完整性检测操作人：复核人：日期：日期：操作人：复核人：附灭菌的温度打印记录操作人：复核人：日期：操作人：复核人：日期：检查人：复核人：日期：7.4.2灌装环境的清洁、消毒效果检查及人员着装检查7.4.2.1操作人员微生物监控进入无菌区的人员按照《洁净区人员更衣标准操作规程》（MF149）进行更衣，操作结束后，按照《灌装无菌区人员更衣确认程序》（QA057）对操作者的左手、右手、口罩、胸口处、帽兜额头处、左臂、右臂等部位的微生物数量进行监测。
培养基配制和灭菌方法验证
培养基配制和灭菌方法验证一、培养基配制培养基是一种供养菌落生长的基础物质，可以提供细菌所需的营养物质和环境条件。
培养基的配制是非常关键的步骤，如果配制不当会影响到培养菌落的生长和观察结果的准确性。
1.1固体培养基的配制固体培养基是通过在液体培养基中加入凝固剂（如琼脂）使其凝固，形成固体的培养基。
固体培养基可以用来分离纯菌、观察菌落特征以及保存菌种。
配制固体培养基的主要步骤如下：步骤一：准备配方根据不同的菌种需要，选择适当的培养基配方。
常见的培养基如营养琼脂(NA)、大肠杆菌琼脂(MacConkey)、血琼脂(Blood Agar)等。
步骤二：计量和溶解根据配方，按照适当的比例称量需要的成分，并加入适量的蒸馏水。
然后，将成分加热溶解，直至成分完全溶解。
步骤三：凝固将已溶解的培养基液倒入培养皿或试管中，装入适量的培养基液。
温度下降至约50℃时，可以添加相应的抗生素(如青霉素)等，促进无菌条件的保持。
待培养基液凝固后，即可进行灭菌处理。
1.2液体培养基的配制液体培养基主要用于培养大量的菌落或进行革兰氏染色等实验。
液体培养基的配制步骤与固体培养基配制类似，只是不需要加入凝固剂。
为了确保培养基无菌，常常需要进行灭菌处理。
2.1常见的灭菌方法常见的灭菌方法主要包括以下几种：1)高压灭菌法：利用高温高压的环境，将培养基中的微生物逐一被杀死。
常用的高压灭菌法是使用高压蒸汽灭菌器进行处理。
2)紫外线灭菌法：使用紫外线灭菌器，将细菌暴露在紫外线下，排除细菌生长的可能性。
3)化学灭菌法：使用化学物质，如乙醛、次氯酸钠等，浸泡培养基或在培养基上喷雾，杀灭细菌。
2.2检验培养基灭菌效果的验证方法验证培养基灭菌效果的方法主要有两种：物理指标法和培养法。
1)物理指标法：即通过检测物理指标，如温度、压力等，来验证灭菌效果。
例如，在培养基中放置一个温度计，通过测量温度变化来判断灭菌的有效性。
2)培养法：即将培养基在灭菌前后进行对照培养，观察菌落的生长情况，或通过采样培养基，进行菌种分离和鉴定。
培养基配制和灭菌方法验证
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
5.3.配制批号：日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
6.灭菌后培养基灵敏度检查
6.1.菌液计数结果日期： 年 月 日
2.实施时间为：年月日—年月日。
2、各项目验证结论
1.灭菌前后pH值日期： 年 月 日
配制批号
灭菌前pH值
灭菌后pH值
结果判定
2.外观性状
日期
年 月 日
年 月 日
结果判定
配制批号
灭菌后
保存三周后
3.留点温度计温度记录日期： 年 月 日
配制批号
灭菌后温度℃
结果判定
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
4.指示剂培养结果日期： 年 月 日
1.验证组织与实施
1.1.验证小组成员及职责分工
部门
部门职责
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
培养基的配制
培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。
用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。
在超净台内过滤。
分装到250 mL的玻璃瓶内。
用封口膜封好，-20℃保存，过滤结束时，还要取少许培养基进行菌培，验证培养基是否是无菌。
胎牛血清的处理：没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在56℃条件下灭活30 min。
在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停地摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出来。
注意：刚取出的冻存血清不要立即放入56℃中，因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂，应该放在室温逐渐溶解，然后，再进行灭活处理。
生长培养基的配制：90 mL IMDM中加入大约10 mL的胎牛血清（10% 左右），双抗可以不加。
(有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用)Hanks 和D-Hanks液，以及胰酶的配制Hanks液是一种常用的平衡盐溶液，D-hanks 液是不含钙镁的Hanks液。
它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致，细胞在Hanks 液中可生存几个小时，Hanks液主要用于清洗细胞。
D-Hanks液主要用于配制胰酶。
配制Hanks液需将CaCl2溶于蒸馏水，再将其它试剂配制成溶液，将两次配制的溶液混合，定容。
胰酶是一种常用的细胞消化液，在原代培养时，用胰酶消化，使细胞从组织块中游离出来。
传代培养时，用胰酶消化贴壁的细胞，并分散成单个细胞。
胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度、时间、浓度和pH有关，还与细胞的类型和特性有关。
用于原代培养消化组织块采用的浓度为：0.1% 或 0.125%；用于传代培养采用的胰酶浓度为：0.25%或者0.2%。
胰酶的配制：1）由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子，而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的，所以，胰酶的配制用无钙镁的D-Hank液，避免钙镁离子干扰胰酶的活性。
2）胰酶在pH8.0时活性最强，在过滤除菌前，须用NaHCO3干粉调溶液的pH值。
麦康凯液体培养基配制灭菌程序验证方案
麦康凯液体培养基配制灭菌程序验证方案一、目的验证微生物检测室购买的由广东环凯微生物科技有限公司生产的麦康凯液体培养基的配制和灭菌方法，验证该配制灭菌程序适合于检测室麦康凯液体培养基的配制和灭菌，为培养基配制和灭菌提供正确的操作方法，使培养基配制和灭菌标准化、程序化。
二、适用范围麦康凯液体培养基的配制和灭菌三、职责1.技术负责人1.1为验证组长，负责组织编写并审核验证方案及报告。
负责组织方案及报告的执行。
2.检测室负责人2.1负责验证方案的起草和方案的具体实施；负责验证过程的记录。
3.检测员3.1负责验证方案的具体实施；负责验证过程的记录。
4.经理4.1负责批准方案及报告。
四、作业标准1.概述培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
一般采用商品脱水培养基，临用时按使用说明或相关规定进行称量、配制、调节pH、分装、灭菌等。
应按照生产商提供参数进行培养基的灭菌。
培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH 的改变。
因此，培养基应采用验证的灭菌程序灭菌,培养基灭菌方法和条件，应通过无菌性试验和促生长能力、抑制能力试验进行验证。
灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。
因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验证。
本公司现在检验用培养基的灭菌方法均为湿热灭菌方法。
2.验证实施计划年月至年月3.培训报告审批后，由验证小组组长对报告实施过程中涉及人员进行培训，以保证报告顺利实施，并做好培训记录，培训记录见附件1：《培训情况确认表》。
4.仪器确认4.1确认内容：确认过程所用仪器是否经校验，并有校验合格证且在校验有效期内。
确认所用试剂及菌液是否在有效期内。
4.2标准要求：仪器应已校验，有校验合格证并在校验有效期内。
4.3仪器及试剂的确认记录见附件2：《仪器确认记录》及附件3：《试剂确认记录》5.验证内容5.1取同一批干粉培养基配制三批进行以下验证。
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告一、实验目的1、了解培养基的制备原理和方法。
2、掌握培养基的灭菌技术和操作流程。
3、熟悉无菌操作的基本要求和注意事项。
二、实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
不同的微生物对营养物质的需求不同，因此需要根据培养目的和微生物的特点来选择和配制合适的培养基。
培养基的制备一般包括以下几个步骤：计算、称量、溶解、调节pH 值、分装、包扎。
灭菌是指用物理或化学方法杀死或去除物体上所有微生物（包括芽孢和孢子）的过程。
常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、过滤灭菌等。
本实验采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。
三、实验材料与设备1、实验材料牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂1mol/L NaOH 溶液1mol/L HCl 溶液蒸馏水2、实验设备电子天平高压蒸汽灭菌锅电炉移液管锥形瓶培养皿玻璃棒pH 试纸四、实验步骤1、培养基的制备计算：根据配方计算所需各种成分的用量。
称量：用电子天平准确称量各种成分。
溶解：将称量好的成分依次加入到一定量的蒸馏水中，在电炉上加热搅拌，使其完全溶解。
调节 pH 值：用 1mol/L NaOH 溶液或 1mol/L HCl 溶液调节培养基的 pH 值至所需值（本实验中为 72-74）。
分装：将配制好的培养基趁热分装到锥形瓶和培养皿中。
锥形瓶的装量一般不超过其容积的 2/3，培养皿的装量一般为 15-20ml。
包扎：在锥形瓶口和培养皿盖上包上牛皮纸或报纸，用绳子扎紧。
2、灭菌检查灭菌锅的水位和安全阀，确保正常。
将包扎好的培养基放入灭菌锅中，注意不要摆放过于紧密。
关闭灭菌锅的盖子，拧紧螺丝。
设定灭菌条件：一般为 121℃，15-20min。
启动灭菌锅，开始灭菌。
灭菌结束后，待压力降至零，打开灭菌锅的盖子，取出培养基。
3、无菌检查将灭菌后的培养基放置在 37℃的恒温培养箱中培养 24-48h，检查有无杂菌生长。
五、实验结果与分析1、培养基的制备成功按照配方配制出了所需的培养基，外观呈均匀的液体状态，无沉淀和浑浊现象。
药品微生物限度检查用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证的
药品微生物限度检查用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证的研究张颖安秀华王建平曹凤兰（天士力制药集团股份有限公司，天津300410）摘要目的：本试验通过对药品微生物限度检查用5种培养基的配制方法、灭菌程序以及配制后贮存条件和贮存效期进行验证，确保每次配制的培养基质量均满足2010年版《中国药典》要求。
方法：3次独立试验中确定了培养基的配制方法、灭菌参数（液体程序，121℃,15min）、贮存条件（洁净度为C级的环境）及贮存时间（45天），并对贮存0天、15天、30天和45天的培养基进行适用性检查(包括促生长能力、抑制能力、指示能力和无菌性)。
结果：培养基在贮存0天、15天、30天和45天后的适用性检查结果均满足2010年版《中国药典》对培养基质量控制的要求。
结论：通过该验证试验，确立了培养基的配制方法、灭菌参数、贮存条件及30天的贮存效期。
关键词：微生物限度检查，培养基适用性检查，配制方法，灭菌参数，贮存效期Study on verification of the preparation, sterilization and the storage life of the media usedin drug microbial enumeration TestsZHANG Ying, AN Xiu-hua, WANG jian-ping, CAO feng-lan(Tasly Pharmaceutical group CO., LTD, Tianjin 300410，China)Abstract Objective: In order to ensure the quality of every batch of prepared media which meet Chinese Pharmacopoeia requirement, the media preparation methods, sterilization procedures and the shelf life of prepared media are validated. Methods: The preparation procedure, sterilization parameters( Liquid procedure, 121℃,15min), storage condition(cleanliness environment for class C) and storage time(45 days) of the culture media for each test is determined, the performance of the media after sterilization stored 0 days, 15 days, 30 days and 45 days were checked(included sterilization, growth promotion indicative and inhibitory properties of the media.)Results: All media prepared in three tests which stored 0 days, 15 days, 30 days and 45 days in the cleanliness environment for class C met Chinese Pharmacopoeia requirement. Conclution:The preparation methods, sterilization procedures and the storage life of the 30 days of prepared media is confirmed through the verification test.Key Words: microbiological examination，applicability inspection of the culture medium, media preparation methods, sterilization parameters , storage life of prepared media培养基是否合格，对微生物的生长、分离、鉴定及检验结果的正确与否起着至关重要的作用，因此，对培养基的质量控制十分必要。
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检查项目
第一天
第二天
第三天
结果判定
阴性对照管
金黄色葡萄球菌管
铜绿假单胞菌管
生孢梭菌管
枯草芽孢杆菌管
6.3.培养基灵敏度检查结果日期： 年 月 日
配制批号
检查项目
第一天
第二天
第三天
结果判定
阴性对照管
金黄色葡萄球菌管
铜绿假单胞菌管
生孢梭菌管
枯草芽孢杆菌管
6.4.培养基灵敏度检查结果日期： 年 月 日
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证方案
文件编码：
项目
姓名
签名
日 期
起 草
审 核
审 核
批 准
生效日期
年 份
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法
验证方案目录
1、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证计划
2、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证小组名单
3、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证方案
4、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证培训记录
5.组织实施
5.1.验证机构的组成
5.2.公司验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织、审批验证方案和验证报告、发放验证证书。
5.3.硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证工作小组，负责该验证项目的验证方案起草、实施、组织与协调实施，负责验证样品检测，完成各项记录，根据检验和验证结果进行评定、完成验证报告。
c.分装 将已调节好PH值的硫乙醇酸盐流体培养基分装至25×250ml试管中，分装的管数为190～200管范围，用牛皮纸按40管/捆的方式包扎结实。其中一管只装约20ml，以备灭菌后最终pH值测定。
d.灭菌器中的培养基的数量及装载方式（满载）
将分装好的5捆（40管/捆）培养基试管置于灭菌器中，按下图A、B、C、D、E 5点放置。
d.取同一批硫乙醇酸盐流体干粉培养基配制三批进行以下验证。
4.2.2.配制灭菌过程
a.称量 取硫乙醇酸盐流体干粉培养基克,加纯化水1000ml,加热煮沸使其完全溶解。每次按照此处方量配制8547ml。
b.灭菌前的pH值测定 取已配制好的硫乙醇酸盐流体培养基100ml，放冷至25℃调节PH值至范围内。以此比例来调节剩下的培养基的pH值。
根据培养基的特性，按制定的方法进行配制和灭菌，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行培养基的配制和灭菌，若不符合，重新制定方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证项目及认可标准
验证内容
验证项目
验证标准
配制
灭菌前的pH
灭菌
灭菌温度
121℃
灭菌时间
15分钟
灭菌效果（F0值）
菌株代数
培养基
培养温度
培养时间（小时）
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
4.2.验证内容
4.2.1.执行标准
a.配制容器及配套器具的清洗严格按照《玻璃器皿清洗操作规程》执行。
b.培养基的配制严格按照《培养基管理规程》执行。
c.自动台式灭菌器严格按照《型台式灭菌器使用维护保养操作规程》执行.
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用，若保存在2～8℃，可在24 小时内使用。
培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养三天，逐日观察结果。
结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
A B C
灭菌器柜门
D E
指示菌的放置：将指示剂嗜热脂肪芽孢菌（菌浓度：×106cfu/支）5支各放入5捆培养基中间的其中一支试管，同时将已编号的5支校正好的留点温度计插入6支待灭菌培养基试管内，开始灭菌。
将已装载好的硫乙醇酸盐流体培养基在121℃条件下灭菌15分钟。灭菌结束后记录各留点温度计点温度。同时取出5支已灭菌嗜热脂肪芽孢菌，直接置56～60℃培养24～48小时，另取一支未经灭菌的嗜热脂肪芽孢菌指示剂一起培养，作为阳性对照。
指示菌名称
菌液浓度（cfu/ml）
标准浓度
平板1
平板2
平均菌落数
金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26 003]
＜100
铜绿假单胞菌 [CMCC(B) 10 104]
生孢梭菌 [CMCC(B) 64 941]
枯草芽孢杆菌 [CMCC(B) 63 501]
6.2.培养基灵敏度检查结果日期： 年 月 日
配制批号
灭菌后指示剂颜色
结果判定
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
阳性对照
5.灭菌后培养基无菌性检查
5.1.配制批号：日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
5.2.配制批号： 日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
2.实施时间为：年月日—年月日。
2、各项目验证结论
1.灭菌前后pH值日期： 年 月 日
配制批号
灭菌前pH值
灭菌后pH值
结果判定
2.外观性状
日期
年 月 日
年 月 日
结果判定
配制批号
灭菌后
保存三周后
3.留点温度计温度记录日期： 年 月 日
配制批号
灭菌后温度℃
结果判定
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
4.指示剂培养结果日期： 年 月 日
a.无菌性检查
每批培养基随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
b.灵敏度检查
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu（菌落形成单位） 的菌悬液。
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告
操作实施
验证
委员会
方案审定、批准、实施、发放验证合格证
方案审核
方案批准
4、附件及相关表格文件
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证报告
文件编码：
项 目
姓 名
签 名
日 期
起 草
审 核
审 核
批 准
生效日期
年 份
1、验证概述
判定
7.2.培养基无菌性检查结果 配制批号：日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
7.3.培养基无菌性检查结果 配制批号：日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
贮存中培养基发生颜色变化、浑浊；固体培养基表面产生裂缝或涟漪等异常现象，不符合使用规定时，应停止使用，重新进行配制和灭菌程序验证。
4.2.3.硫乙醇酸盐流体培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
5.3.配制批号：日期： 年 月 日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
6.灭菌后培养基灵敏度检查
6.1.菌液计数结果日期： 年 月 日
1.验证组织与实施
1.1.验证小组成员及职责分工
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告