正常核型急性髓系白血病NPM1基因突变的临床分析(新)
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所有患者在获得知情同意后抽取骨髓液 5 ml，用 于常规免疫表型和细胞遗传学分析，剩余骨髓液用淋 巴细胞分离液分离出单个核细胞， 采用传统酚-氯仿 抽提法提取 DNA，去离子水稀释 DNA 至 50 μg／μl， -20 ℃保存备用，应用紫外分光光度仪测定样本的吸 光度（A）值。
1.2.3 NPM1 基因扩增 参照文献［10］设计合成 NPM1 基因的第 12 号外
· 532 ·
白血病·淋巴瘤 2016 年 9 月第 25 卷第 9 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, September 2016, Vol. 25, No. 9
过表达等， 导致该类患者预后具有显著异质性［2-4］， 如正常核型伴单一的 NPM1、CEBPd 突变已被美国国 立综合癌症网络（NCCN）列为预后良好组，FLT3-ITD 则被视为预后不良的标志［5］。 NPM1 基因突变是 AML 中最常见的一种基因突变， 发生率为 25 ％～35 ％， 而在正常核型 AML（CN-AML）患者中突变率更高。 多 项研究证实 NPM1 基因突变的 CN-AML 患者具有较 高的骨髓原始细胞计数、较高的外周血白细胞和血小 板计数，合并 FLT3 突变时更明显；在标准化疗后有明 显较高的完全缓解（CR）率；是 CR、无病生存（DFS）、 总生存（OS）独立的较好预后因素［1，6-8］。 为探讨伴有 NPM1 基因突变的 CN-AML 与伴有野生型 NPM1 的 CN-AML 患者之间临床特征是否存在较大的差异，本 研究分析了 190 例 CN-AML 患者中 NPM1 突变的发 生情况，并分析其相关临床特点和治疗效果。
3 讨论
CN-AML 患者过去被划分为预后中等组，然而研 究发现这组患者的预后存在着相当大的差异，因此以 核型为基础的 AML 分型并不能让人满意， 需在分子 水平进一步发现新的预后相关因素［1，11］。 过去十余年 里，许多强烈影响 CN-AML 患者预后的基因突变及基 因表达相继被发现，如 FLT3 基因突变、NPM1 基因突 变等［3，12］。
【关键词】 白血病，髓样，急性； 基因，NPM1； 突变 基金项目： 湖北省自然科学基金 （2013CFB075）； 华中科技大学自主创新研究基金 （重点专项） （2014ZHYX023）
NPM1 mutation in acute myeloid leukemia with normal karyotype: a clinical analysis Huang Chun, Yang Shijia, Wu Sijing, Li Dengju Department of Hematology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China[Huang C (Department of Hematology, Brain Hospital of Wuhan), Yang SJ, Wu SJ, Li DJ] Corresponding author: Li Dengju, Email: lidengju@gmail.com
DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.09.004
【摘要】 目的 分析具有正常核型的急性髓系白血病（CN-AML）患者 NPM1 基因突变情况及其临床 意义。 方法 回顾性分析 2008 年 1 月至 2015 年 6 月年同济医院血液内科收治的 190 例初发 CN-AML 患者的临床资料。 对比研究 NPM1 突变型与野生型 CN-AML 患者之间临床特征和治疗效果的差异。 结 果 190 例 CN-AML 患者中 44 例（23.16 %）出现 NPM1 基因突变。 与野生组比较，突变组患者外周血白细 胞计数高 （60.0×109／L 比 75.7×109／L，P＜0.05）， 骨髓中原始细胞比例高 （63.87 %比 75.82 %，P＜ 0.05），初次化疗缓解（完全缓解 + 部分缓解）率高［56.91 %（45／79）比 70.09 %（22／31），P＜0.05］。 结论 NPM1 基因突变与 CN-AML 高肿瘤负荷以及高诱导化疗缓解率具有相关性。
白血病·淋巴瘤 2016 年 9 月第 25 卷第 9 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, September 2016, Vol. 25, No. 9
正常核型急性源自文库系白血病 NPM1 基因突变的 临床分析
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·论著·
黄纯 杨时佳 吴思静 李登举 430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科［黄纯（现在武汉市脑科 医院血液内科）、杨时佳、 吴思静、 李登举］ 通信作者：李登举，Email：lidengju@gmail.com
【Key words】 Leukemia, myeloid, acute; NPM1 gene; Mutation Fund program: Natural Science Foundation of Hubei Province (2013CFB075); Independent Innovation Research Foundation of Huazhong University of Science and Technology (Key Special Projects) （2014ZHYX023）
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取 2008 年 1 月至 2015 年 6 月华中科技大学 同济医学院附属同济医院血液内科住院的初诊 AML 患者，所有患者均经过骨髓细胞形态学、免疫 表型、染色体和融合基因检查确诊。 筛选出 CN-AML 患者 190 例进行临床回顾性分析，其中男性 100 例， 女性 90 例，平均年龄 43.6 岁（15～74 岁）。 参照法、 美、英协作组（FAB）标准及世界卫生组织（WHO）标 准：M0 3 例、M1 24 例、M2 56 例、M3 0 例 、M4 3 例、M5 101 例、M6 3 例。 分别筛选出 NPM1 突变组与野生组 CN-AML 患者进行比较研究。 参照文献［9］标准判 断疗效。 初次化疗的缓解率以 CR 加部分缓解（PR） 计算。
NPM1 基因定位于染色体 5q35， 含有 12 个外显 子，其编码的核磷蛋白 NPM 主要定位于核仁区，参与 调节中心体的复制、核糖体蛋白质组装、细胞核与细 胞质之间的物质转运及调节 p53 通路等。 NPM1 基因 突变后 （最常见的为 NPM1 基因 12 号外显子 4 个碱 基对的重复）， 导致该基因缺乏胞核定位信号而积聚 在细胞质内，而突变的 NPM1 蛋白又可通过二聚体化 使野生型 NPM1 蛋白分布异常，干扰正常核磷蛋白功 能 。 ［6-7，13］ NPM1 基因丢失或易位导致融合蛋白形成， 促进血液系统肿瘤的发生， 被认为是 AML 最常见的 一种基因突变类型［6- 。 7，12］ NPM1 突变在所有成年人 AML 中的发生率约为 30 ％，而在染色体正常的成年 人 AML 中发生率为 50 ％～60 ％，NPM1 基因的过表
【Abstract】 Objective To investigate the frequency of NPM1 mutation and its clinical significance in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia (CN-AML). Methods The data of 190 patients with CN-AML were collected from Department of Hematology, Tongji Hospital between January 2008 and June 2015, and the discrepancies in clinical features and efficacy between CN-AML patients with NPM1 mutation and those without NPM1 mutation were also analyzed. Results Among the 190 CN-AML patients, NPM1 mutation was found in 44 patients (23.16 % ). The proportion of bone marrow blast cells and the count of peripheral white blood cells in patients with NPM1 mutation were higher than those in patients without NPM1 mutation (75.82 % vs. 63.87 % , P ＜0.05; 75.7 ×109/L vs. 60.0 ×109/L, P ＜0.05). The rate of response (complete remission + partial remission) in patients with NPM1 mutation was also higher than that in patients without NPM1 mutation [70.09 %(22/31) vs. 56.91 %(45/79), P ＜0.05) ]. Conclusion NPM1 mutation is associated with higher tumor burden and higher remission rate in CN-AML patients.
1.2 方法
1.2.1 染色体核型分析 所有病例标本应用 R 显带技术进行核型分析。
治疗前抽取患者骨髓 5 ml，肝素抗凝，采用直接法及 不加植物血凝素的短期培养法制备染色体标本，然后 采取改良的热处理吉姆萨 R 显带技术分析 20 个以 上分裂象细胞核型，核型按《人类细胞遗传学国际命 名体制（ISCN2005）》进行描述。 1.2.2 基因组 DNA 提取
显子引物： 正义链 5'-TFAACTCTCTGGTGGTAGAAT GAA-3'，反义链 5'-CAAGACTATITllGCCATTCCTAAC3'，由上海英俊公司合成。 聚合酶链反应（PCR）总体系 25 μl，反应条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s（40 个循环），72 ℃延伸 10 min，4 ℃保 存。 PCR 产物在 2 g／L 琼脂糖凝胶上进行电泳，EB 染色后紫外灯下观察目的条带约为 560 bp。 用 5'AAAAGGACAGCCAGATATCAAC-3' 测序引物对扩增 产物进行直接测序，结果与正常序列比对，在测序引 物后 80 bp 范围内出现重叠峰的标本为 NPM1 基因 突变阳性标本。
1.3 统计学方法
直接观察指标采用描述性分析。 定量资料用均数 表示，两组间比较采用 t 检验；分类资料的比较采用 χ2 检验，样本量＜40 时采用 Fisher 确切概率法。 检 验水准定为 α＝0.05。
2 结果
与野生组比较， 突变组患者外周血白细胞计数 平均值高（P＜0.05），骨髓中原始细胞比例高（63.87 % 比 75.82 %，P＜0.05）； 初次化疗缓解率高 ［56.91 % （45／79）比 70.09 %（22／31），P＜0.05］（表 1）。
急性髓系白血病（AML）是一类具有遗传学异质 性的疾病，40 ％～49 ％的成年人 AML 及 25 ％的儿 童 AML 为正常核型，预后分层时被归入中危组，但是
其远期的预后情况却很难判断［1］。 因为多种获得性基 因的改变， 如 FLT3 突变、NPM1 突变、CEBPA 突变、 MLL 突变、KIT 突变以及 BAALC、MN1 及 ERG1 基因
1.2.3 NPM1 基因扩增 参照文献［10］设计合成 NPM1 基因的第 12 号外
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白血病·淋巴瘤 2016 年 9 月第 25 卷第 9 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, September 2016, Vol. 25, No. 9
过表达等， 导致该类患者预后具有显著异质性［2-4］， 如正常核型伴单一的 NPM1、CEBPd 突变已被美国国 立综合癌症网络（NCCN）列为预后良好组，FLT3-ITD 则被视为预后不良的标志［5］。 NPM1 基因突变是 AML 中最常见的一种基因突变， 发生率为 25 ％～35 ％， 而在正常核型 AML（CN-AML）患者中突变率更高。 多 项研究证实 NPM1 基因突变的 CN-AML 患者具有较 高的骨髓原始细胞计数、较高的外周血白细胞和血小 板计数，合并 FLT3 突变时更明显；在标准化疗后有明 显较高的完全缓解（CR）率；是 CR、无病生存（DFS）、 总生存（OS）独立的较好预后因素［1，6-8］。 为探讨伴有 NPM1 基因突变的 CN-AML 与伴有野生型 NPM1 的 CN-AML 患者之间临床特征是否存在较大的差异，本 研究分析了 190 例 CN-AML 患者中 NPM1 突变的发 生情况，并分析其相关临床特点和治疗效果。
3 讨论
CN-AML 患者过去被划分为预后中等组，然而研 究发现这组患者的预后存在着相当大的差异，因此以 核型为基础的 AML 分型并不能让人满意， 需在分子 水平进一步发现新的预后相关因素［1，11］。 过去十余年 里，许多强烈影响 CN-AML 患者预后的基因突变及基 因表达相继被发现，如 FLT3 基因突变、NPM1 基因突 变等［3，12］。
【关键词】 白血病，髓样，急性； 基因，NPM1； 突变 基金项目： 湖北省自然科学基金 （2013CFB075）； 华中科技大学自主创新研究基金 （重点专项） （2014ZHYX023）
NPM1 mutation in acute myeloid leukemia with normal karyotype: a clinical analysis Huang Chun, Yang Shijia, Wu Sijing, Li Dengju Department of Hematology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China[Huang C (Department of Hematology, Brain Hospital of Wuhan), Yang SJ, Wu SJ, Li DJ] Corresponding author: Li Dengju, Email: lidengju@gmail.com
DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.09.004
【摘要】 目的 分析具有正常核型的急性髓系白血病（CN-AML）患者 NPM1 基因突变情况及其临床 意义。 方法 回顾性分析 2008 年 1 月至 2015 年 6 月年同济医院血液内科收治的 190 例初发 CN-AML 患者的临床资料。 对比研究 NPM1 突变型与野生型 CN-AML 患者之间临床特征和治疗效果的差异。 结 果 190 例 CN-AML 患者中 44 例（23.16 %）出现 NPM1 基因突变。 与野生组比较，突变组患者外周血白细 胞计数高 （60.0×109／L 比 75.7×109／L，P＜0.05）， 骨髓中原始细胞比例高 （63.87 %比 75.82 %，P＜ 0.05），初次化疗缓解（完全缓解 + 部分缓解）率高［56.91 %（45／79）比 70.09 %（22／31），P＜0.05］。 结论 NPM1 基因突变与 CN-AML 高肿瘤负荷以及高诱导化疗缓解率具有相关性。
白血病·淋巴瘤 2016 年 9 月第 25 卷第 9 期 Journal of Leukemia & Lymphoma, September 2016, Vol. 25, No. 9
正常核型急性源自文库系白血病 NPM1 基因突变的 临床分析
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黄纯 杨时佳 吴思静 李登举 430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科［黄纯（现在武汉市脑科 医院血液内科）、杨时佳、 吴思静、 李登举］ 通信作者：李登举，Email：lidengju@gmail.com
【Key words】 Leukemia, myeloid, acute; NPM1 gene; Mutation Fund program: Natural Science Foundation of Hubei Province (2013CFB075); Independent Innovation Research Foundation of Huazhong University of Science and Technology (Key Special Projects) （2014ZHYX023）
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取 2008 年 1 月至 2015 年 6 月华中科技大学 同济医学院附属同济医院血液内科住院的初诊 AML 患者，所有患者均经过骨髓细胞形态学、免疫 表型、染色体和融合基因检查确诊。 筛选出 CN-AML 患者 190 例进行临床回顾性分析，其中男性 100 例， 女性 90 例，平均年龄 43.6 岁（15～74 岁）。 参照法、 美、英协作组（FAB）标准及世界卫生组织（WHO）标 准：M0 3 例、M1 24 例、M2 56 例、M3 0 例 、M4 3 例、M5 101 例、M6 3 例。 分别筛选出 NPM1 突变组与野生组 CN-AML 患者进行比较研究。 参照文献［9］标准判 断疗效。 初次化疗的缓解率以 CR 加部分缓解（PR） 计算。
NPM1 基因定位于染色体 5q35， 含有 12 个外显 子，其编码的核磷蛋白 NPM 主要定位于核仁区，参与 调节中心体的复制、核糖体蛋白质组装、细胞核与细 胞质之间的物质转运及调节 p53 通路等。 NPM1 基因 突变后 （最常见的为 NPM1 基因 12 号外显子 4 个碱 基对的重复）， 导致该基因缺乏胞核定位信号而积聚 在细胞质内，而突变的 NPM1 蛋白又可通过二聚体化 使野生型 NPM1 蛋白分布异常，干扰正常核磷蛋白功 能 。 ［6-7，13］ NPM1 基因丢失或易位导致融合蛋白形成， 促进血液系统肿瘤的发生， 被认为是 AML 最常见的 一种基因突变类型［6- 。 7，12］ NPM1 突变在所有成年人 AML 中的发生率约为 30 ％，而在染色体正常的成年 人 AML 中发生率为 50 ％～60 ％，NPM1 基因的过表
【Abstract】 Objective To investigate the frequency of NPM1 mutation and its clinical significance in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia (CN-AML). Methods The data of 190 patients with CN-AML were collected from Department of Hematology, Tongji Hospital between January 2008 and June 2015, and the discrepancies in clinical features and efficacy between CN-AML patients with NPM1 mutation and those without NPM1 mutation were also analyzed. Results Among the 190 CN-AML patients, NPM1 mutation was found in 44 patients (23.16 % ). The proportion of bone marrow blast cells and the count of peripheral white blood cells in patients with NPM1 mutation were higher than those in patients without NPM1 mutation (75.82 % vs. 63.87 % , P ＜0.05; 75.7 ×109/L vs. 60.0 ×109/L, P ＜0.05). The rate of response (complete remission + partial remission) in patients with NPM1 mutation was also higher than that in patients without NPM1 mutation [70.09 %(22/31) vs. 56.91 %(45/79), P ＜0.05) ]. Conclusion NPM1 mutation is associated with higher tumor burden and higher remission rate in CN-AML patients.
1.2 方法
1.2.1 染色体核型分析 所有病例标本应用 R 显带技术进行核型分析。
治疗前抽取患者骨髓 5 ml，肝素抗凝，采用直接法及 不加植物血凝素的短期培养法制备染色体标本，然后 采取改良的热处理吉姆萨 R 显带技术分析 20 个以 上分裂象细胞核型，核型按《人类细胞遗传学国际命 名体制（ISCN2005）》进行描述。 1.2.2 基因组 DNA 提取
显子引物： 正义链 5'-TFAACTCTCTGGTGGTAGAAT GAA-3'，反义链 5'-CAAGACTATITllGCCATTCCTAAC3'，由上海英俊公司合成。 聚合酶链反应（PCR）总体系 25 μl，反应条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s（40 个循环），72 ℃延伸 10 min，4 ℃保 存。 PCR 产物在 2 g／L 琼脂糖凝胶上进行电泳，EB 染色后紫外灯下观察目的条带约为 560 bp。 用 5'AAAAGGACAGCCAGATATCAAC-3' 测序引物对扩增 产物进行直接测序，结果与正常序列比对，在测序引 物后 80 bp 范围内出现重叠峰的标本为 NPM1 基因 突变阳性标本。
1.3 统计学方法
直接观察指标采用描述性分析。 定量资料用均数 表示，两组间比较采用 t 检验；分类资料的比较采用 χ2 检验，样本量＜40 时采用 Fisher 确切概率法。 检 验水准定为 α＝0.05。
2 结果
与野生组比较， 突变组患者外周血白细胞计数 平均值高（P＜0.05），骨髓中原始细胞比例高（63.87 % 比 75.82 %，P＜0.05）； 初次化疗缓解率高 ［56.91 % （45／79）比 70.09 %（22／31），P＜0.05］（表 1）。
急性髓系白血病（AML）是一类具有遗传学异质 性的疾病，40 ％～49 ％的成年人 AML 及 25 ％的儿 童 AML 为正常核型，预后分层时被归入中危组，但是
其远期的预后情况却很难判断［1］。 因为多种获得性基 因的改变， 如 FLT3 突变、NPM1 突变、CEBPA 突变、 MLL 突变、KIT 突变以及 BAALC、MN1 及 ERG1 基因